卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其死亡率占妇科恶性肿瘤的首位。虽然手术方式、化疗、放射治疗等手段不断改进,但5年生存率仍徘徊在30%-40%,而且发病年龄日趋年轻化。近年来,随着人们健康意识的提高、检查手段的进步,很多早期卵巢癌被及时发现和诊治。怎样使患者得到更有效、更安全的治疗,提高患者的生存率和生活质量,保护年轻患者的生殖内分泌功能成为卵巢癌研究的新热点。“促性腺激素理论”认为促性腺激素对卵巢癌生长起促进作用。促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)对促性腺激素的降调节作用在理论上能够抑制卵巢癌的生长和增殖。GnRH是下丘脑释放的十肽激素,主要作用是调控垂体卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone, LH)的合成与分泌,维持正常的生殖系统功能。由于GnRH的半衰期很短,一般应用其类似物(包括激动剂和拮抗剂)来进行相关研究和应用。基础研究报道GnRH激动剂或拮抗剂能够抑制体外培养的卵巢癌细胞生长,提示GnRH类似物在H-P-O轴外也有作用。有研究推测轴外作用是通过GnRH受体(gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR)产生的。哺乳动物GnRHR有两型：GnRHR 1和GnRHR2。另一方而,研究显示青春期前的儿童暴露于化疗药物造成卵巢功能损害的比例只有10%。提示临床上可以人为创造暂时的青春期前环境,保护卵巢功能免受化疗药物的损害。GnRH能够抑制H-P-O轴,抑制FSH和LH的分泌,使卵巢功能处于青春期前水平,理论上能够对卵巢功能起到保护作用。抗苗勒管激素(Anti-Mullerian hormone, AMH)是卵巢颗粒细胞分泌的糖蛋白激素,研究提示AMH能够抑制卵泡的初始募集和循环募集,调控卵泡发育的过程,是能够早期反应卵巢功能的指标。本研究从体外细胞实验和体内动物实验两方面证实GnRH类似物的抑制卵巢癌和保护卵巢功能的双重调节作用,并比较GnRH激动剂和拮抗剂的作用差异。这将为临床选择应用GnRH激动剂或拮抗剂治疗卵巢癌、保护卵巢功能提供实验依据。本研究分别选用GnRH激动剂goserelin和拮抗剂cetrorelix作为实验药物。课题共分四个部分：1.GnRH类似物对卵巢癌细胞生长、增殖的影响；2.人卵巢颗粒细胞体外培养,检测GnRH类似物对颗粒细胞分泌AMH、E2和P的影响；3. GnRH类似物对裸鼠皮下移植瘤和裸鼠卵巢功能的双重调节作用；4.临床资料研究,分析GnRHR与卵巢癌临床分期和病理分级的相关性。第一部分GnRH类似物对卵巢癌细胞生长、增殖的影响目的研究GnRH类似物对卵巢癌细胞生长、增殖的影响。方法用RT-PCR方法检测卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3-ip上GnRHRl和GnRHR2基因的表达。分别用不同浓度(0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)GnRH激动剂goserelin或拮抗剂cetrorelix作用于ES-2和SKOV3-ip细胞,24 h后用磺基罗丹明染色(SRB)法检测细胞增殖情况。分别用10"5 mol/L goserelin或cetrorelix作用于ES-2和SKOV3-ip细胞14天,观察细胞集落形成情况。应用流式细胞仪分析10-5 mol/L goserelin或cetrorelix作用于ES-2或SKOV3--ip细胞24 h后对细胞周期的影响。蛋白印迹法检测10-5 mol/L goserelin或cetrorelix作用于ES-2和SKOV3-ip细胞24 h后,对细胞周期蛋白cyclinB1和cyclinD1表达的影响。以及10-5 mol/L goserelin或cetrorelix作用不同时间(0、15、30、60、120、240 min)对ES-2和SKOV3-ip细胞pAKT蛋白表达的影响。结果ES-2和SKOV3-ip细胞株均表达GnRHR1和GnRHR2。SRB结果提示GnRH激动剂和拮抗剂均不同程度抑制了ES-2和SKOV3-ip细胞的增殖,且浓度越高抑制越明显。在ES-2细胞株,10-5 mol/L cetrorelix的抑制作用比10-5mol/Lgoserelin更明显(P<0.05)。10-5 mol/L goserelin或cetrorelix能抑制卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3-ip集落形成；在SKOV3-ip细胞株,cetrorelix的抑制作用大于goserelin (P<0.05)。细胞周期结果提示goserelin和cetrorelix均能略微增加S期细胞比例,但差异没有统计学意义(P>0.05)。Goserelin和cetrorelix均能使ES-2和SKOV3-ip细胞周期蛋白cyclin B1的表达降低,使cyclin D1的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹法检测提示10-5 mol/L goserelin或cetrorelix作用达2h及以上均能抑制ES-2和SKOV3-ip细胞pAKT蛋白的表达。结论ES-2和SKOV3-ip细胞株均表达GnRHR1和GnRHR2。GnRH激动剂和拮抗剂均能抑制卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3-ip的生长和增殖。第二部分GnRH类似物对卵巢颗粒细胞分泌AMH、E2和P的影响目的研究GnRH类似物对卵巢颗粒细胞分泌AMH、E2和P的影响。方法用免疫细胞化学方法检测原代分离培养的人卵巢颗粒细胞上Calretinin、Inhibinα、EMA、Vimentin、CD99、Desmin、CD34的表达,并进行油红染色和H-E染色鉴定颗粒细胞。用免疫细胞化学方法检测颗粒细胞上GnRHR1和GnRHR2的表达情况。分别用顺铂(DDP)、goserelin、goserelin+DDP、cetrorelix或cetrorelix+DDP处理颗粒细胞24 h后,用ELISA方法检测颗粒细胞分泌AMH的水平,用化学发光法检测颗粒细胞分泌E2和P的水平。结果免疫细胞化学方法证明颗粒细胞上存在GnRHR1和GnRHR2表达。Goserelin能上调颗粒细胞分泌AMH的水平,cetrorelix能明显上调颗粒细胞分泌AMH的水平(P<0.05)；但goserelin和cetrorelix对E2和P的分泌无明显影响(P>0.05)。结论颗粒细胞上存在GnRHR1和GnRHR2表达。GnRH类似物能上调颗粒细胞AMH的分泌。第三部分GnRH类似物对裸鼠皮下移植瘤和卵巢功能的双重调节作用目的研究GnRH类似物对裸鼠皮下移植瘤和卵巢功能的双重调节作用。方法ES-2细胞连续培养传代后调整浓度为2.5×107/ml取0.2 ml注射于36只裸鼠右侧肩胛区皮下,随机分为6组。处理如下：(1)生理盐水(NS)组：皮下注射NS 0.1 ml/天；一周后腹腔注射NS 0.2 ml/周。(2)DDP组：皮下注射NS 0.1 ml/天；一周后腹腔注射5 mg/kg DDP(稀释至0.2 m1)/周。(3) goserelin组：皮下注射100μg goserelin(稀释至0.1 m1)/天；一周后腹腔注射NS 0.2 ml/周。(4)goserelin+DDP组：皮下注射100μg goserelin(稀释至0.1 m1)/天；周后腹腔注射5 mg/kg DDP(稀释至0.2 m1)/周。(5) cetrorelix组：皮下注射100μg cetrorelix(稀释至0.1 m1)/天；一周后腹腔注射NS 0.2 ml/周。(6)cetrorelix+DDP组：皮下注射100μg cetrorelix(稀释至0.1 m1)/天；一周后腹腔注射5 mg/kg DDP(稀释至0.2 m1)/周。比较各组裸鼠体重、移植瘤体积、移植瘤组织Ki-67表达情况、动情周期、血AMH、FSH、E2和P的分泌、卵巢各级卵泡比例和卵巢体积的差异。卵巢组织和移植瘤切片H-E染色观察病理形态学变化。结果各组裸鼠体重变化无明显差异(P>0.05)。用药第12天开始,DDP组、goserelin组、goserelin+DDP组、cetrorelix组、etrorelix+DDP组肿瘤体积均明显小于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。DDP组、goserelin组和goserelin+DDP组移植瘤组织Ki-67的表达明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,goserelin组、goserelin+DDP组和cetrorelix组的动情次数明显减少(P<0.05)；goserelin+DDP组动情周期时间明显延长(P<0.05)。Goserelin组裸鼠血中AMH的表达明显高于空白对照组(P<0.05),各组裸鼠血中FSH、E2和P的变化无明显统计学差异(P>0.05)。Goserelin组卵泡闭锁率明显小于DDP组(P<0.05)。Goserelin组、goserelin+DDP组、cetrorelix组和cetrorelix+DDP组原始卵泡+窦前卵泡率明显高于DDP组(P<0.05)。病理形态学观察到DDP组卵巢组织间质纤维化明显,卵泡数量减少,窦前卵泡减少,各级卵泡均出现较高比例闭锁。空白对照组移植瘤增殖活跃、分化差、并出现肝转移。结论Goserelin或cetrorelix能抑制裸鼠皮下移植瘤生长和增殖同时上调AMH分泌、减少裸鼠动情次数、延长动情周期、增加原始卵泡+窦前卵泡率,保护卵巢功能。第四部分GnRHR在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与卵巢癌临床分期、病理分级的关系目的研究GnRHR (GnRHR1和GnRHR2)在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与卵巢癌临床分期、病理分级的关系。方法用免疫组织化学的方法分别检测GnRHR 1和GnRHR2在54例上皮性卵巢癌组织中的表达,分别统计分析GnRHR 1、GnRHR2表达量与卵巢癌临床分期和病理分级及肿瘤转移的关系。结果GnRHR1在Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌组织中的表达明显高于Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌(P=0.001)。GnRHR2在Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌组织中的表达亦明显高于Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌(P<0.001)。GnRHR2在高分化的卵巢癌组织中的表达明显高于中分化和低分化的卵巢癌组织(P<0.001)。GnRHR1在不同病理分级的卵巢癌组织中的表达无明显统计学差异(P>0.05)。GnRHR1和GnRHR2在卵巢癌原发灶和转移灶中的表达无明显统计学差异(P>0.05)。GnRHR1和GnRHR2之间在表达量上无明显相关性。结论GnRHR1和GnRHR2在卵巢癌组织中广泛表达。GnRHR1和GnRHR2在Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌中表达较高。GnRHR2在高分化的卵巢癌中的表达较高。GnRHR1和GnRHR2与卵巢癌生长、增殖密切相关。综上所述,GnRH类似物goserelin或cetrorelix能抑制卵巢癌细胞生长和增殖、抑制裸鼠皮下移植瘤的生长和增殖。上调颗粒细胞分泌AMH,抑制卵泡募集,降低生长卵泡对FSH的敏感性,增加原始卵泡+窦前卵泡率,减少裸鼠动情次数、延长动情周期,从而保护卵巢功能。在裸鼠体内实验中同时观察到上述两种作用。这为临床应用GnRH类似物对年轻、早期卵巢癌患者进行卵巢癌治疗和生殖内分泌功能保护提供了实验依据。