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研究背景:利用细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)中丰富的蛋白和因子进行组织损伤修复是目前研究热点之一,与之相应的基质依赖型组织工程骨(Extracellular matrix-based tissue-engineered bone,ECM-TEB)是一种用于修复骨缺损的新发展建立起来且有前景的方法。骨重建的动态平衡是靠骨组织内各类细胞的相互协作来实现。故在ECM-TEB构建中若能包含不同类型的细胞进行共培养,将更加真实的模拟体内成骨的微环境。维持骨稳态最重要的两种功能细胞是成骨细胞(osteoblast,OB)和破骨细胞(osteoclast,OC)。其中OC执行骨吸收,而OB主导骨形成。这两种细胞的相互作用和耦连是骨修复的关键。有研究发现前体破骨细胞(preosteoclast,POC)分泌的血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)能促进骨形成和血管化的相互耦联,提示破骨相关细胞在骨修复和其血管化中起着关键作用。此外,内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)可分化为血管内皮细胞(endothelial cell,EC),生成血管,且在特定微环境下可促进间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)归巢与成骨。因此,在MSC作为成骨分化的种子细胞的同时,将POC或EPC作为―复合型‖种子细胞引入,可能是一种修复骨缺损有效的策略。方法:我们构建了MSC ECM-TEB,MSC+POC ECM-TEB,MSC+EPC ECM-TEB,MSC+POC+EPC ECM-TEB这4种基质依赖型组织工程骨。首先使用扫描电子显微镜(scanning eletron microscope,SEM)观察其表面形态。然后以细胞依赖型组织工程骨(cell-based tissue engineering bone,Cell-TEB)作为对照组,冻干后形成的ECM-TEB作为实验组,通过混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)实验、主要相容性复合体-I和II(major compatibility complexes-I and II,MHC-I and MHC-II)和脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的免疫荧光和DNA定量测试实验检测对照组与实验组的免疫原性。在体内,建立SD大鼠直径为4mm的圆柱形股骨缺损模型以评估成骨能力,并以此作为评价ECM-TEB修复骨缺损的金标准。在体外,以MSC ECM-TEB作为对照组,除了检测修复效果最佳的ECM-TEB的实验组在细胞迁移,粘附和成骨分化方面的表现外,还采用iTRAQ标记的质谱(mass spectrometry,MS)蛋白质组学分析,以发现导致不同ECM-TEB在骨修复存在差异的关键成分。对于质谱分析出的关键差异成分胰岛素样生长因子结合蛋白5(insulin-like growth factor binding protein 5,IGFBP5)和C-X-C基序趋化因子12(C-X-C motif chemokine12,CXCL12),通过加入中和抗体的方法,采用实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术、茜素红和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色,划痕实验和Transwell细胞迁移实验分别检测其生物学功能。结果:ECM-TEB的免疫原性相比于Cell-TEB大幅降低,抗原成分(MHC-I,MHC-II和DNA片段)在荧光显微镜下没有显示,且双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)<50 ng/ml。在体内实验中,micro-CT结果和Masson切片染色结果均显示,同空白支架和MSC-TEB相比,植入MSC+EPC ECM-TEB和MSC+POC+EPC ECM-TEB后,大部分缺损修复完成,而植入MSC+POC ECM-TEB后,缺损修复基本完成,表明其在促进成骨方面存在显著优势。随后,以MSC ECM-TEB为对照组,MSC+POC ECM-TEB为实验组的体外实验结果表明,从MSC+POC ECM-TEB中释放的约3 mg/ml生物活性蛋白还促进了MSC在体外的迁移、粘附和成骨分化。对于机制的研究,用于相对和绝对定量的等压标签(isobaric labels for relative and absolute quantification,iTRAQ)标记的质谱分析结果表明324种蛋白显著上调,其中以CXCL12和IGFBP5最为显著,其可分别促进MSC的迁移和成骨分化,该结果通过中和抗体实验获得证实。结论:总的来说,本研究通过改变种子细胞的种类,优化了基质依赖型组织工程骨的构建方案,可明显增强骨修复的效果,这为骨组织工程带来新的技术策略。