草鱼卵泡抑素(Follistatin)重复基因的克隆和功能研究

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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国的四大家鱼之一,在淡水鱼类中有着重要的经济地位。草鱼的个体大,性成熟时间晚,同其他养殖鱼类一样,并未形成较有优势的品系,而传统的育种方式则需要较高的成本和较长的时间。发掘主效基因的功能是进行水产动物遗传育种基础研究的重要内容,从基因型选育优良品种可能是一种有效而快捷的方式。虽然水产动物中应用尚不多,但有一定的应用前景。卵泡抑素(Follistatin, Fst)是一种富含半胱氨酸残基的单链糖基化多肽物质,以旁分泌或者自分泌的方式,结合转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员,包括Myostatin (MSTN)。MSTN是目前发现的对骨骼肌发育和生长起负调控作用的最强抑制物,研究表明Fst能够在MSTN与相应体结合之前阻断其通路,抑制MSTN基因的负性调节,从而恢复肌肉的生长。本文获得了草鱼fst-1/2重复基因cDNA的全长序列,fst-1和fst-2基因全长分别为1341bp和1376bp,开放阅读框分别为969bp和1053bp,分别编码322个和350个氨基酸。与人类和斑马鱼一样,草鱼成熟fst-1和fst-2多肽也包含4个区域:N-domain、Domain I、Domain II和Domain III,其中N-domain含有6个半胱氨酸基团,DomainI、Domain II和Domain III三个功能区各含10个。草鱼fst-1和fst-2氨基酸编码区的相似度为78%,草鱼fst-1和fst-2的编码区与人、斑马鱼的相比相似度都达到85%以上。不同胚胎时期RT-PCR分析结果表明,草鱼fst-1和fst-2基因具有不同的表达模式。在正常状态下,草鱼胚胎发育各阶段中fst-1表达量较为恒定,差异不显著;而fst-2直到16hpf时才开始表达,但是从16hpf至40hpf表达量呈逐渐降低的趋势。在成年草鱼中,fst-1在除脾和肠之外的所有组织中均有表达,而fst-2则主要在眼和慢肌中表达。整胚原位杂交结果显示,在草鱼胚胎中fst-1mRNA则在脑、后脑和骨骼肌肌节的外缘处表达,fst-2mRNA则在脑部和骨骼肌表达。进一步通过显微注射过量表达fst-1基因没有对草鱼造成明显的体型变化,而fst-2基因在草鱼胚胎中,体形上有明显的变化,会导致草鱼胚胎的背部向卵黄囊外弯曲,尾巴上翘。进一步采用Tgf2转座子介导了Fsts基因在鲤鱼、草鱼、团头鲂的转基因研究,转基因团头鲂与对照组相比体长增加显著,个体明显大与对照。结果显示说明通过增加Fsts蛋白提高动物肌肉产量存在一定可行性。上述研究结果表明,草鱼Fsts重复基因功能即保守而又存在明显差异,它们在草鱼的胚胎发育和成体生长过程中起着重要作用。
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