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研究目的临床上,急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症可由感染、吸入性损伤、严重烧伤等引起,其中感染是主要因素。分离培养人羊膜上皮细胞(human Amniotic Epithelial Cells,hAECs)并鉴定其表型;hAECs 对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)进行干预,观察hAECs对LPS引起的ALI组织病理、肺干湿重比、灌洗液蛋白浓度以及炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-10)的影响。研究方法1、人羊膜上皮细胞的分离培养鉴定hAECs原代细胞的分离培养采用胰蛋白酶与胶原酶两种酶复合消化的方式;细胞生长至融合度80%时,采用“胰蛋白酶两步消化法”进行细胞的消化传代;采用梯度降温的方式进行冻存。倒置显微镜观察细胞形态,细胞免疫荧光染色鉴定hAECs角蛋白CK-19抗原表达,选择P2细胞进行流式表面抗原的鉴定,抗原包括CD34、CD45、CD90、CD105、HLA-DR、SSEA-4。2、hAECs对LPS致ALI干预效果气管暴露滴注5mg/kg剂量的LPS建立ALI模型。52只体重200±20g的Wistar大鼠随机分为三组,其中假伤组12只,LPS致伤组20只,hAECs干预组20只。假伤组:气管滴注200 μ L生理盐水,尾静脉注射200 μ L PBS;致伤组:气管滴注LPS 200μ L(5mg/kg),尾静脉注射200 μ L PBS;hAECs干预组:气管滴注LPS 200 μ L,1h后尾静脉注射200 μ L细胞悬液。所有组别分别于6、24、48、72h腹主动脉放血处死,进行取材,行肺大体观察后,常规方法做湿干重比,HE染色光镜下观察组织病理,BCA法测支气管肺泡灌洗液蛋白浓度,Elisa检测肺组织匀浆中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10 浓度。研究结果1、人羊膜上皮细胞的分离培养鉴定结果倒置显微镜观察,人羊膜上皮细胞呈上皮特有的铺路石样排布,且P2细胞生长状态良好;角蛋白CK-19表达阳性;流式鉴定结果为SSEA-4、CD90呈阳性表达,CD105、CD34、CD45、HLA-DR 为阴性表达。2、hAECs对LPS致ALI干预效果肺组织肉眼观察与组织病理观察:假伤组肺表面光滑红润,未见出血点,未见水肿出现;LPS致伤组肺体积膨胀,出现水肿,表面可见出血点,颜色呈暗红,受损程度随时间递增;hAECs干预组仅48、72h相较于致伤组有所改善。假伤组肺泡结构完整清晰,肺泡间质无增厚,无明显渗出,未见水肿、炎症因子浸润等变化;LPS致伤组,肺泡腔变小,肺间质增厚,肺泡腔中有渗出液,偶有“马蹄状”炎性细胞,随着时间的延后损伤程度增加;hAECs干预组,48、72h肺损伤程度与损伤组比有所改善,肺间质厚度降低,肺泡萎缩减少,但与假伤组相比hAECs干预组的肺损伤仍存在。湿千重比:与假伤组相比,致伤组各时间点湿干重比水平显著升高(P<0.01);与致伤组比,hAECs干预组各时间点湿干重比水平显著降低(P<0.01)。BALF蛋白浓度变化:与假伤组相比,致伤组各时间点BALF蛋白浓度显著升高(P<0.05),干预组在24、48、72h时蛋白浓度显著升高(P<0.05);与致伤组相比,干预组各时间点蛋白浓度均低于致伤组,6、72h差异具有统计学差异(P<0.05)。炎症因子变化:与假伤组相比,致伤组各时间点的TNF-α、IL-6和IL-10浓度显著升高(P<0.05),干预组各时间点的TNF-α、IL-6和IL-10浓度显著升高(P<0.05);与致伤组相比,干预组各时间点的TNF-α、IL-6浓度显著降低(P<0.05),干预组各时间点的IL-10浓度显著升高(P<0.05);假伤组中TNF-α、IL-6和IL-10浓度基本稳定,致伤组中,TNF-α、IL-6峰值出现在6h,后随时间降低,IL-10浓度峰值出现在24h,后随时间降低。干预组的变化趋势与致伤组相同结论1、本研究应用胶原酶-胰蛋白酶复合消化法和胰蛋白酶两步消化法对人羊膜上皮细胞进行分离、传代,形态学、CK19免疫荧光染色和表面抗原流式鉴定证实所获得细胞为人羊膜上皮细胞,且纯度高、生长状态良好,为人羊膜上皮细胞库的建立以及人羊膜上皮细胞的应用研究提供了保障。2、hAECs可以减轻LPS致ALI模型中炎症反应,缓解组织水肿,对LPS引起的ALI有一定的治疗作用。