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目的本研究旨在检测胰腺癌中GSK-3β的表达,探讨GSK-3β的表达与胰腺癌临床病理特征的关系,进而深入探讨其在胰腺癌发生、发展中的作用。方法运用免疫组织化学SP法检测65例胰腺癌组织及10例癌旁胰腺组织中GSK-3β的表达。结果在65例胰腺癌标本中33例出现GSK-3β的阳性表达,而在癌旁胰腺组织未检测到GSK-3β的阳性表达(P<0.01)。GSK-3β蛋白的表达与胰腺癌患者的年龄、性别和肿瘤大小无关,但与胰腺癌的分化程度、转移和临床分期有关(P<0.05)。结论GSK-3β的高表达在胰腺癌的发生发展和浸润转移过程中起着重要作用。GSK-3β可能与胰腺癌患者的预后的密切相关。目的构建针对人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出基因沉默效果最佳的shRNA质粒表达载体；转染人胰腺癌细胞株PANC-1,建立稳定表达GSK-3βshRNA的细胞模型。方法针对GSK-3p基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,PCR,测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,Real-time PCR检测GSK-3βmRNA被抑制情况。选取效应最强的重组质粒和阴性对照质粒转染的PANC-1细胞,经G418筛选后,建立稳定表达GSK-3βshRNA的PANC-1细胞株(实验组)和稳定表达control shRNA的PANC-1细胞株(阴性对照组),未转染的PANC-1细胞株设为空白对照组。采用荧光显微镜和FCM观察细胞的转染情况；Real-time PCR和Western blot分析GSK-3β的表达。结果1、经测序证实,成功构建GSK-3βshRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致；2、重组质粒瞬时转染PANC-1细胞后,GSK-3βmRNA明显下调(P<0.05),其中以2号重组质粒效应最强；3、重组质粒稳定转染后检测PANC-1细胞中GSK-3β的表达,Real-time PCR和’Western blot结果均提示：与空白对照组和载体对照组比较,实验组中GSK-3βmRNA和蛋白的表达均显著降低(P<0.05)。结论本研究成功构建了携带以GSK-3β为靶向的shRNA的重组质粒。经脂质体途径稳定转染的PANC-1细胞,该shRNA能够显著抑制GSK-3β的表达。该实验为进一步研究GSK-3β的功能和以其为靶点的肿瘤的基因治疗提供了基础。目的本实验拟在体外观察基因沉默GSK-3β对胰腺癌PANC-1细胞的增殖、凋亡、周期和侵袭能力的影响,并初步探讨相关的分子机制及GSK-3β作为胰腺癌治疗靶点的可能性。方法实验分组如下：空白对照组为未转染的PANC-1细胞；载体对照组为稳定转染control shRNA的PANC-1细胞；实验组为稳定转染GSK-3βshRNA的PANC-1细胞。MTT法连续7d检测各组细胞的OD值,并绘制出细胞的生长曲线；FCM检测细胞的凋亡和周期；Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力；Real-time PCR检测各组细胞中bcl-2、cyclin D1、VEGF、HIF-1αmRNA的表达；Western blot检测各组细胞中bcl-2、cyclin D1、HIF-1α蛋白的表达；ELISA检测PANC-1细胞培养上清中VEGF蛋白的浓度；EMSA检测PANC-1细胞中NF-κB的DNA结合活性。结果与对照组比较,转染GSK-3βshRNA的PANC-1细胞生长速度明显减慢；凋亡率明显增加；而且处于G0／G1期细胞比例显著升高,S期细胞比例显著降低,发生明显的G1期阻滞(P<0.05)。实验组PANC-1细胞中bcl-2、cyclin D1、VEGF基因和蛋白的表达显著下调,NF-κB的DNA结合活性降低(P<0.05)。GSK-3p沉默的PANC-1细胞中HIF-1α基因和蛋白的表达出现不一致的变化。结论GSK-3β可能在胰腺癌细胞的增殖、存活和侵袭中具有重要作用,阻断GSK-3β的表达可望成为胰腺癌分子靶向治疗的新途径。目的探讨基因沉默GSK-3β对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响。方法人胰腺癌PANC-1细胞接种于裸鼠皮下,建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,分为空白对照组(种植未转染的PANC-1细胞)、载体对照组(种植转染control shRNA的PANC-1细胞)和实验组(种植转染GSK-3βshRNA的PANC-1细胞),测量各组移植瘤的重量和体积,并计算抑瘤率；免疫组化SP法检测PCNA和FⅧ蛋白的表达,并计算增殖指数(SPF)和微血管密度(MVD)；Real-time PCR和Western blot检测VEGF基因和蛋白的表达。结果实验组移植瘤的重量和体积显著低于对照组(P<0.05),抑瘤率为35.27%；实验组SPF和MVD值均小于对照组(P<0.05)；实验组移植瘤的VEGF基因和蛋白的表达较对照组显著降低(P<0.05)。结论在体内,基因干扰GSK-3β的表达可以显著抑制PANC-1细胞接种的裸鼠皮下移植瘤的生长和新生血管的形成,该效应可能与其下调VEGF的表达有关。目的探讨RNA干扰GSK-3β后,人胰腺癌PANC-1细胞对吉西他滨敏感性的改变。方法实验分组如下：空白对照组为未转染的PANC-1细胞；载体对照组为稳定转染control shRNA的PANC-1细胞；实验组为稳定转染GSK-3p shRNA的PANC-1细胞。在各组PANC-1细胞中加入不同浓度吉西他滨并作用48h；MTT检测各组细胞的增殖活性；FCM检测各组细胞的凋亡率。结果在吉西他滨作用48h后,实验组中PANC-1细胞的生长抑制率、凋亡率均显著高于对照组,而且该效应与剂量成正比,高剂量引起高抑制(P<0.05)；结论基因干扰GSK-3p的表达可显著增强吉西他滨对胰腺癌PANC-1细胞的杀伤力,并伴有NF-κB活性的降低和抗凋亡基因bcl-2的下调,这表明基因沉默GSK-3β可能通过抑制胰腺癌细胞NF-κB的活性,下调与化疗耐药相关的NF-κB的靶基因bc1-2的表达而增强胰腺癌对化疗的敏感性。因此,阻断GSK-3β的表达有望开辟胰腺癌基因治疗的新途径。