目的:通过孟德尔随机化分析讨论吸烟和饮酒两个危险因素对于骨质疏松症发生发展的潜在影响,进一步通过实验发现精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)在骨质疏松人群脂肪细胞内含量高于非骨质疏松人群,进一步研究PRMT5对大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)分化功能的影响;之前有研究发现,microRNA133a(mi R-133a)可以显著抑制人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的成骨分化,蛋白DLX3则发现可以对间充质干细胞成骨分化有正向调控作用,所以可以通过实验证明microRNA133a可以通过靶基因DLX3对于不同细胞系成骨分化的影响,借此发现microRNA133a,DLX3及PRMT5之间的联系,及对于间充质干细胞分化的不同作用机制。本研究拟通过多种体外体内实验研究相关蛋白通过影响间充质干细胞及成骨细胞系的分化,发现多种因素对骨质疏松影响的作用机制。研究方法:1.通过GWAS及相关文献发现吸烟及饮酒相关SNP,进行筛选,与吸烟量(n=3)、饮酒量(n=2)和过量酒精摄入的生物标志物碳水化合物缺乏转铁蛋白(CTD)水平(n=3,CTD浓度;1的CTD浓度;和2的总转铁蛋白)相关联的遗传变异被用作MR分析的仪器。来自32735,28498个和8143个欧洲祖先的来自骨质疏松联合体的遗传因素的汇总统计数据被用来产生遗传工具与股骨颈(FN-BMD)、腰椎(LS-BMD)和前臂(FA-BMD)的关联。通过孟德尔随机化分析(MR)研究吸烟及饮酒对骨质疏松的影响。2.取得盛京医院脊柱关节骨科行髋关节置换患者的骨组织标本,分为骨质疏松组和非骨质疏松组。取股骨头内脂肪细胞组织。生理盐水冲洗后,切取冠状断面,纵向采集软骨帽至股骨下段的骨髓组织标本,进行组织固定和脱钙。用免疫组化染色。用光学显微镜在10倍、20倍和40倍放大率下观察切片。细胞核周围和脂肪细胞核内的棕色染色为阳性表达。用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMMSCsP3代,BMMSCs经流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29低表达、CD45、CD90的高表达。将生长状态良好的P3代BMMSCs分为正常对照组、AM组(成脂诱导),分别加入不同浓度的PRMT5抑制剂,EPZ015666,P1组(0.1μmol/L EPZ015666),P2组(1μmol/L EPZ015666)行成脂诱导分化,通过油红O染色阳性细胞数的变化。实时荧光定量PCR检测加入不同浓度的EPZ015666的大鼠BMMSCs中,成脂分化调控基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2,PPARγ2)的mRNA的表达变化,也包括FABP4 mRNA的表达情况。用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测各组细胞PPARγ2,FABP4蛋白表达的变化改变情况。3.在成骨分化的过程中,miR-133a的表达量显著下调。应用实时荧光定量PCR的方法检测miR-133a在成骨细胞MC3T3-E1分化过程中的表达。为了诱导MC3T3-E1细胞向成骨分化,培养基用无血清d-MEM和300ng/ml的BMP-2取代正常培养基。成骨分化后,检测了成骨分化表型标记物Runx2、ALP和OCN。miR-133a能抑制成骨分化。研究miR-133a相应的过表达和抑制剂对成骨分化的影响。将mi R-133a mimics/inhibitor和阴性对照转染到MC3T3-E1细胞中。采用实时荧光定量PCR检mimics/inhibitor的干扰效率和Runx2、ALP和0CN的表达。Western blot法检查OCN蛋白的表达,用碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测C2C12细胞的成骨分化。通过生物信息学网站Mirdb.org预测miR-133a的靶基因。预测结果显示DLX3可能作为miR-133a的靶基因。因此,我们进行了荧光素酶活性验证,共转染野生型小鼠,UTR荧光素酶报告基因质粒(WT)和突变型质粒(MUT)与miR-133a mimics/inhibitor,转到MC3T3-E1细胞中,检测荧光素酶的活性改变。为了验证miR-133a靶向结合于DLX3,将miR-133a转染到小鼠C2C12细胞中,Western blot检测DLX3蛋白的表达。结果:1.遗传预测的每日吸烟量(CPD)与较低的FN-BMD相关(-0.014 SD在每一个CPD增加的BMD中(95%CI,-0.027至-0.0002;P=0.047))。LS-BMD和FA-BMD有相似的作用,但在样本量较小的情况下未达到统计学意义(P=0.17和0.27)。通过使用酒精饮用相关的变量或CTD水平相关的变量作为工具,对于酒精消费,我们没有发现任何重要的关联BMD的结果。2.(1)与非骨质疏松症患者骨髓脂肪细胞相比,骨质疏松症患者骨髓脂肪组织中PRMT5的表达水平升高。股骨颈脂肪细胞免疫组化染色显示骨质疏松症患者脂肪细胞PRMT5表达明显高于对照组。(2)大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中PRMT5水平相对恒定。选择p3体外生长良好的骨髓间充质干细胞进行后续的骨髓间充质干细胞实验。骨髓间充质干细胞CD29和CD90表达阳性,阳性率分别为99.92%和99.95%。相比之下,CD45阳性率为2.51%。因此,我们认为分离的细胞是高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞。p3代骨髓间充质干细胞在脂肪细胞诱导培养基(AM)中培养;随后加入于由地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)组成的分化混合物诱导剂后分化为脂肪细胞。成脂诱导2周后进行油红O染色;与对照组相比,成脂诱导组细胞浆中的红脂滴数量增加。Western blot分析表明,成脂诱导后PRMT5蛋白水平显著升高。我们在脂肪细胞分化模型中检测了PRMT5的蛋白水平。加入分化鸡尾酒诱导剂两周后PRMT5蛋白水平升高。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为对照。我们的结论是PRMT5蛋白水平在大鼠BMMSCs成脂诱导过程中升高。(3)PRMT5抑制剂EPZ015666可抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成脂分化。提取了大鼠原代间充质干细胞,并在成脂培养基中进行培养。体外P3大鼠骨髓间充质干细胞在成脂培养基中培养2周,脂滴出现在细胞浆中,并逐渐增多。成脂诱导2周后,油红O染色观察细胞内脂滴,发现随着EPZ015666浓度的增加(0.1μM,1μM),EPZ015666浓度为1μM组别中诱导的细胞内的脂滴明显减少。我们发现PRMT5可以促进大鼠骨髓间充质干细胞的成脂分化,而PRMT5的抑制剂EPZ015666可以抑制大鼠骨髓间充质干细胞向成脂分化。(4)PRMT5促进大鼠BMMSCs脂肪细胞PPARγ2下游基因和蛋白的表达。用QRT-PCR法检测0.1μM和1μM EPZ015666孵育2周后大鼠骨髓间充质干细胞中成脂分化标志物PPARγ2的表达。与对照组相比,经PRMT5抑制剂EPZ015666处理的大鼠骨髓间充质干细胞中PPARγ2的表达水平显著降低。高浓度EPZ015666对于PPARγ2的抑制作用更强。在相同条件下检测到FABP4的表达水平发现,高浓度EPZ015666处理的细胞显示出低表达水平的FABP4。因此PRMT5可以调节大鼠BMMSCs内的PPARγ2和FABP4的表达。3.(1)在成骨分化的过程中,mi R-133a的表达量显著下调。用BMP-2诱导C2C12细胞和MC3T3-El细胞成骨分化后,我们发现成骨分化基因Runx2、ALP和0CN的mRNA水平明显上调。上述结果表明,我们已经成功地诱导成骨分化。与对照组相比,BMP-2诱导组miR-133a的表达量显著下调。我们的研究表明,mi R-133a可能对成骨分化起到重要的调控作用。(2)miR-133a能抑制成骨分化。miR-133a的mimics/inhibitor和阴性对照转染到MC3T3-E1和C2C12细胞后48h,我们验证了mi RNA mimics/inhibitor的干扰效率。转染miR-133a抑制剂到MC3T3-E1和C2C12细胞中,24h无血清培养后,用QRT-PCR检测Runx2、ALP和OCN的表达,发现这些基因的mRNA表达显著上调。相反,MC3T3-E1和C2C12细胞中转染miR-133a mimics,结果显示成骨分化基因mRNA的表达水平显著下调。C2C12细胞中转染miR-133a inhibitor后OCN蛋白表达显著增加,转染其mimics后OCN蛋白表达显著下降。在诱导分化7d后,与对照组相比,ALP染色结果显示在miR-133a过表达组的蓝色明显变浅,而miR-133a抑制剂组的蓝色则明显深。在诱导分化14d后,茜素红染色结果显示,基质矿化水平得到相似的结果。我们的数据表明,mi R-133a能抑制成骨细胞分化。(3)mi R-133a靶向结合DLX3。miR-133a和DLX3质粒共转染到MC3T3-E1细胞系中,DLX3野生型组(WT)显示出明显抑制荧光素酶活性,可是突变组(Mut)没有显示出荧光素酶活性的改变。通过实验发现,在MC3T3-E1细胞中过表达miR-133a,会明显抑制DLX3蛋白水平,而mi R-133a抑制组,DLX3蛋白表达增加。这些数据表明,miR-133a可能抑制基因DLX3的表达。结论:1、在我们的研究中发现吸烟量可能与骨密度有因果关系,没有观察到饮酒和骨密度之间潜在的因果关系。2、精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)在骨质疏松人群中股骨头脂肪细胞内含量明显高于非骨质疏松组人群中股骨头脂肪细胞内含量。大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中PRMT5水平相对恒定。PRMT5抑制剂EPZ015666可抑制大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化。PRMT5促进大鼠BMMSCs脂肪细胞内PPARγ2下游基因和蛋白PPARγ2和FABP4的表达。3、在成骨分化的过程中,miR-133a的表达量显著下调,且能抑制成骨分化;mi R-133a靶向结合DLX3,通过靶向结合DLX3抑制成骨分化。