论文部分内容阅读
T-DNA标签是一种高通量的分离和克隆植物功能基因的方法,目前在拟南芥等双子叶植物中已得到广泛应用,但在水稻等单子叶植物中尚处于探索阶段。本文通过对4416份T1代水稻T-DNA标签系的筛选,对T-DNA插入产生的突变类型、不同性状的突变频率、表型突变体的筛选程序、T-DNA侧翼序列的分离方法及整合特性等进行了研究和探讨;对获得的一个颖花颖壳缺失的突变体,进行了对应基因的克隆、功能验证、表达模式分析;对一个多重颖壳突变体开展了形态学观察和初步遗传分析。获得的主要研究结论有:1、对以中花11（ZH11）、中花15（ZH15）为受体亲本构建的4416份T1代标签系进行了表型鉴定,发现存在拟纯合突变和系内分离突变两种类型;突变表型涉及株高、生育期、叶形、叶色、分蘖力、植株松紧度、穗颈节、穗形、颖花、粒形、类病变、雄性不育、生长极性等14类性状。其中,株高、生育期、叶色、雄性不育等性状有着相对较高的突变频率（>1%）,株高和叶色的突变频率在品种及年度间表现稳定,而生育期、雄性不育波动较大,表明这类性状的表型易受环境影响。通过T1、T2连续世代的共分离分析,初步筛选出3个与穗部或颖花发育相关的T-DNA插入突变体,其频率约为1.37‰。为分离相关功能基因奠定基础。随机选择42份有表型突变的标签系,通过质粒拯救和TAIL-PCR的方法,从39个标签系中分离获得40条T-DNA侧翼序列,其中26条为载体序列,14条与水稻基因组有很好的同源性,Blastn分析结果表明T-DNA有优先整合进植物功能基因内部的特性。建立的质粒拯救和TAIL-PCR两种分离T-DNA侧翼序列的方法,相比较而言,前者对某个特定标签系,筛选含有T-DNA侧翼序列的阳性克隆获得率及测序效率较高,分离片段较长,但对DNA质量要求较高,操作过程繁琐,工作量较大;而后者对大规模分离侧翼序列、建立侧翼序列库而言扩增效率较高,且操作简单、方便、快捷,但就某个特定标签系特异PCR产物的获得率相对较低,且分离的序列片段一般长度较短。两种方法结合使用,对某个特定标签系其侧翼序列的分离就会有很大的几率。2、对一个初步确认的颖花颖壳退化的T-DNA插入突变体（degenerated hull1,dh1）,开展了基因克隆和功能分析研究。解剖镜观察结果表明dh1突变体表现为大部分颖花（≈70%）的内、外稃缺失,同时伴有雌雄蕊数目的异常,少量颖花（≈30%）