随着西方化饮食习惯对国民的影响,含果糖的软饮料如可乐、果汁等的摄入量逐年增加,致使果糖的摄入量增加。高果糖饮食的危害也逐渐被认识。果糖过量摄入可引起代谢综合征的表现如血脂异常、脂肪肝、胰岛素抵抗、体质量增加、血压增高及高尿酸血症。高果糖饮食引起胰岛素抵抗的机制尚不确切。骨骼肌是胰岛素抵抗发生的主要器官,骨骼肌中脂质沉积、线粒体结构紊乱与胰岛素抵抗密切相关。研究表明,氧化应激是导致线粒体功能障碍、机体组织损伤、胰岛素抵抗和2型糖尿病发生发展的病理机制。硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)是细胞内主要的硫醇还原剂,通过调节细胞内氧化还原状态,参与细胞内多种信号通路转导过程,具有二硫化物还原酶活性,通过抗氧化效应,减轻组织氧化应激损伤。硫氧还原蛋白相互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是TRX的内源性抑制剂,通过绑定/抑制TRX的活性,破坏细胞内氧化还原平衡,促进氧化应激,而抑制或敲除TXNIP具有明显的组织保护作用。最新研究表明TRX/TXNIP可经多种途径参与糖脂代谢的病理生理过程。胰高血糖素样肽1(glucagon like peptide-1,GLP-1)类似物是一种新型的降糖药物,可促进胰岛素的生物合成和分泌,保护胰岛β细胞,改善胰岛素抵抗,抑制胰高血糖素的分泌,抑制食欲及摄食,延缓胃内容物排空,从而降低血糖并使之维持在恒定水平。目前GLP-1受体激动剂在改善高果糖引起的胰岛素抵抗和骨骼肌线粒体功能损害方面的研究不多,因此,本研究首先建立了高果糖诱导的胰岛素抵抗大鼠模型,其后通过多种方法观察高果糖饮食喂养大鼠体内胰岛素抵抗发生及骨骼肌氧化应激的情况,探讨了GLP-1受体激动剂对高果糖诱导胰岛素抵抗大鼠骨骼肌的作用及其可能机制,为临床用药提供理论依据。第一部分GLP-1RA对高果糖诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌糖脂代谢的影响目的:研究GLP-1受体激动剂对胰岛素抵抗大鼠糖脂代谢、线粒体功能的影响。方法:雄性SD大鼠60只(体重180g-200g),适应性喂养1周后,随机分为2组:正常对照组(normal diet,ND)18只和高果糖组(high frctose diet,HFD)30只。正常对照组予普通饲料进行喂养,高果糖组予等热量的高果糖饲料进行喂养。喂养8周后每组随机抽取6只大鼠,进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验,通过计算葡萄糖输注率(glucose infusion rate,GIR)来评估其胰岛素敏感性,腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)检测各时间点血糖值和葡萄糖曲线下面积(AUCglu),随后处死大鼠并留取血液及骨骼肌组织标本。高果糖诱导胰岛素抵抗大鼠造模成功后,将剩余高果糖组大鼠随机分为3组:高果糖饮食模型组(HFD)、高果糖+吡格列酮(pioglitazone,Pio)组、高果糖+艾塞那肽组(HFG),继续进行高果糖喂养并给予相应药物干预6周,每周称量体重并重新计算给药剂量;药物干预6周后,检测IPGTT,各时间点血糖值并计算AUCglu,行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验,计算GIR后处死大鼠,留取血清及骨骼肌标本,测空腹血糖(blood glucose,GLU)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。电镜观察骨骼肌细胞线粒体超微结构;检测大鼠骨骼肌糖脂代谢相关因子:肉碱棕榈酰转运酶-1(carnitine palmitoyl transterase-1β,CPT-1β)、中链脂酰辅酶脱氢酶(medium chain acyl-Co A dehydrogenase,MCAD)、长链脂酰辅酶脱氢酶(long-chain acyl-Co A dehydrogenase,LCAD)、脂肪酸移位酶(fatty acid translocase,FAT/CD36)、骨骼肌葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT-4)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,mtTFA)、核呼吸因子(nuclear respiratory factors-1,Nrf-1)的表达及骨骼肌组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和谷胱甘肽(glutathione,GSH)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性改变。结果:1.与ND组比较,HFD组大鼠在喂养8周后体重明显增加(P<0.05);HFD组大鼠IPGTT结果AUCglu明显高于ND组(P<0.05),提示糖耐量减低;而GIR明显低于ND组(P<0.05),提示成功建立高果糖诱导胰岛素抵抗模型。2.大鼠体重变化比较:HFD组大鼠2周、4周、6周体重均明显高于ND组(P<0.05);HFG组和Pio组干预后大鼠2周、4周、6周体重较HFD组降低(P<0.05)。3.各组大鼠生化指标比较:HFD组大鼠后GLU、TC、TG、LDL-C均明显高于ND组,差异具有统计学意义(P<0.05);HFG组和Pio组大鼠GLU、TC、TG、LDL-C均较HFD组降低(P<0.05)。4.大鼠糖耐量、葡萄糖输注量比较:药物干预6周喂养结束时,HFD组大鼠AUCglu均明显高于ND组(P<0.05),HFG组和Pio组大鼠AUCglu均较HFD组降低(P<0.05);HFD组大鼠GIR均明显低于ND组(P<0.05),HFG组和Pio组大鼠GIR较HFD组升高(P<0.05)。5.大鼠骨骼肌线粒体形态变化比较:电镜下可见ND组大鼠骨骼肌细胞质内无明显脂滴沉积,线粒体清晰且丰富、肌纤维和肌节排列规整;HFD组大鼠骨骼肌细胞内可见较多脂滴沉积,核位于肌膜下方,线粒体肿胀,空泡化明显,提示肌细胞脂质沉积和线粒体损伤;HFG组脂滴较HFD组明显减少,线粒体空泡化减轻,肌浆网扩张不明显,糖原、颗粒、脂滴明显减少,线粒体肿胀有所改善。6.大鼠线粒体脂肪酸氧化相关酶CPT-1β、MCAD、LCAD活性的改变:HFD组大鼠CPT-1β、MCAD、LCAD活性均明显低于ND组(P<0.05);HFG组和Pio组大鼠CPT-1β、MCAD、LCAD活性均较HFD组显著提高(P<0.05)。7.与ND组大鼠相比,HFD组大鼠骨骼肌FAT/CD36、PGC-1α、核呼吸因子Nrf-1和线粒体转录因子A(mtTFA)蛋白水平显著降低(P<0.05),与HFD组比较,HFG组和Pio组大鼠骨骼肌FAT/CD36、PGC-1α、Nrf-1和mtTFA蛋白水平显著增加(P<0.05)。与ND组大鼠相比,HFD组骨骼肌GLUT-4表达较ND组明显降低,HFG组和Pio组大鼠GLUT-4蛋白均较HFD组增加(P<0.05)。8.骨骼肌组织MDA含量和GSH、CAT、SOD活性改变:HFD组与ND组比较,骨骼肌组织中MDA含量升高,GSH、SOD、CAT活性明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与HFD比较,HFG组和Pio组大鼠能显著降低大鼠MDA水平,升高GSH、SOD、CAT活力(P<0.05)。小结:1.高果糖饮食可以诱导大鼠脂质异常、骨骼肌脂质沉积,形成胰岛素抵抗。2.GLP-1受体激动剂Ex-4可调节线粒体糖脂代谢,改善骨骼肌脂质沉积;改善糖耐量,增加大鼠胰岛素敏感性,减少高果糖引起的线粒体氧化应激。第二部分GLP-1RA对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌TRX/TXNIP表达的影响目的:研究GLP-1受体激动剂对胰岛素抵抗大鼠TRX/TXNIP表达的影响及相关通路探讨。方法:建立大鼠胰岛素抵抗模型,随机分为四组,正常对照组(ND)、高果糖饮食模型组(HFD)、高果糖+吡格列酮组(pioglitazone,Pio)、高果糖+Ex-4组(HFG),药物干预6周后,RT-PCR和Western blot方法检测骨骼肌组织硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)、硫氧还蛋白(thioredoxin1,TRX1)、NF-E2相关因子1(nuclear factor erythroid 2 related factor 1,Nrf1)、蛋白激酶/磷酸化蛋白激酶B(Akt/p-Akt)、丝裂原活化的蛋白激酶/磷酸化丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK/p-MAPK)mRNA及蛋白表达水平。结果:1.RT-PCR结果显示,与ND组比较,HFD组大鼠骨骼肌TXNIP mRNA、Akt、MAPK mRNA明显升高;而TRX1、Nrf1 mRNA表达较ND组明显降低;HFG组和Pio组大鼠TXNIP mRNA水平、Akt、MAPK mRNA均较HFD组降低(P<0.05),而TRX1、Nrf1 mRNA表达较HFD组明显升高(P<0.05)。2.Western Blot结果显示,与ND组比较,HFD组大鼠骨骼肌TXNIP、Akt、MAPK蛋白表达明显升高(P<0.05);而TRX1、Nrf1、p-Akt、p-MAPK蛋白表达较ND组明显降低(P<0.05);HFG组和Pio组大鼠TXNIP、Akt、MAPK较HFD组降低(P<0.05),而TRX1、Nrf1、p-Akt、p-MAPK蛋白表达较HFD组明显升高(P<0.05)。小结:GLP-1受体激动剂Ex-4能够改善高果糖诱导的骨骼肌胰岛素抵抗。其机制与调控TRX/TXNIP的表达水平,以及调控Nrf1、Akt、MAPK信号通路有关。第三部分GLP-1RA通过调节TRX/TXNIP的表达影响骨骼肌细胞线粒体功能目的:体外细胞实验进一步证实GLP-1受体激动剂对胰岛素抵抗细胞模型TRX/TXNIP表达的影响及相关通路探讨。方法:培养L6骨骼肌细胞,将其诱导分化为肌管,显微镜观察L6细胞分化情况,构建L6细胞胰岛素抵抗模型并鉴定。分组如下:正常组(ND)、高果糖组(HFD)、高果糖+Ex-4组(HFG)、高果糖+sh TXNIP组(HFD+TXNIP(-))、高糖+TXNIP慢病毒转染+Ex-4组(HFG+TXNIP(+));测定各组细胞培养基GLU、TG浓度;电镜观察骨骼肌细胞线粒体形态变化;RT-PCR检测CPT-1β、MCAD、LCAD表达水平,Western blot检测FAT/CD36、GLUT-4、PGC-1α、mtTFA及NQO1和HO-1蛋白在骨骼肌表达;RT-PCR检测骨骼肌组织TXNIP、TRX1、Nrf1、Akt、MAPK mRNA水平;Western blot法检测骨骼肌组织TXNIP、TRX1、Nrf1、Akt、MAPK、p-Akt、p-MAPK的蛋白水平。结果:1成肌细胞诱导分化成肌管诱导L6细胞分化后,显微镜观察到梭形成肌细胞相互聚集,逐渐形成肌管;连接蛋白(desmin)和肌细胞生成素(myogenin)的mRNA表达均明显升高(P<0.05),提示诱导L6细胞分化成功。2胰岛素抵抗模型鉴定分化后的L6细胞经高果糖干预24小时后,HFD组细胞培养基GLU显著高于ND组(如图3所示),差异有统计学意义(P<0.05),油红O染色显示HFD组红染部分较ND组明显增多,表明高果糖诱导的IR体外细胞模型已成功建立。3 L6细胞培养基葡萄糖浓度与ND组比较,HFD组葡萄糖浓度显著升高(P<0.05);与HFD组比较,HFG组及HFD+sh TXNIP组葡萄糖浓度显著降低(P<0.05),与HFG组比较,HFG+TXNIP过表达组葡萄糖含量显著升高(P<0.05)。4细胞TG浓度与ND组比较,HFD组TG含量显著升高(P<0.05);与HFD组比较,HFG组及HFD+sh TXNIP组TG含量显著降低(P<0.05),与HFG组比较,HFG+TXNIP过表达组TG含量显著升高(P<0.05)。5 L6细胞糖脂代谢影响5.1 RT-PCR检测L6细胞CPT-1β、MCAD、LCAD mRNA表达变化与ND组比较,HFD组CPT-1β、MCAD、LCAD mRNA表达水平均显著降低(P<0.05);与HFD相比,HFG组及HFD+TXNIP(-)组CPT-1β、MCAD、LCAD mRNA均显著增加(P<0.05);与HFG组相比,HFG+TXNIP(+)组CPT-1β、MCAD、LCAD mRNA表达水平明显著降低(P<0.05)。5.2 Western blot检测L6细胞脂质转运及线粒体生物发生相关基因PGC-1α、Nrf-1、mtTFA和FAT/CD36表达的变化与ND组相比,HFD组PGC-1α、Nrf-1、mtTFA、FAT/CD36蛋白水平显著减低(P<0.05);与HFD组相比,HFG组PGC-1α、Nrf-1、mtTFA及PGC-1α蛋白水平显著增加(P<0.05)。HFD组转染sh TXNIP后,细胞PGC-1α、Nrf-1、mtTFA、FAT/CD36的蛋白表达较HFD组显著增加(P<0.05),用Ex-4干预后,HFG组细胞PGC-1α、Nrf-1、mtTFA和FAT/CD36水平明显较HFD组明显升高(P<0.05)。5.3各组葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT-4)表达水平比较与ND组相比,HFD组GLUT-4 mRNA表达水平显著减低(P<0.05);与HFD相比,HFG组及HFD+TXNIP(-)组GLUT-4蛋白水平显著增加(P<0.05);与HFG组相比,HFG+TXNIP(+)组细胞GLUT-4有明显降低(P<0.05)。6 NQO1和HO-1蛋白表达比较与ND组相比,HFD组细胞中抗氧化酶NQO1、HO-1含量降低(P<0.05);与HFD组相比,HFG组及HFD+TXNIP(-)组细胞中抗氧化蛋白酶NQO1、HO-1显著升高(P<0.05);与HFG组相比,HFG+TXNIP(+)组NQO1和HO-1显著降低(P<0.05)。7 GLP-1受体激动剂Ex-4对胰岛素抵抗大鼠TRX/TXNIP表达的影响及相关通路探讨7.1 TXNIP、TRX1、Nrf1、Akt、MAPK的mRNA水平与ND组相比,HFD组细胞中TXNIP、Akt、MAPKmRNA显著升高(P<0.05),TRX1、Nrf1显著降低(P<0.05);与HFD组相比,HFG组及HFD+TXNIP(-)组细胞中TXNIP、Akt、MAPK mRNA均显著降低(P<0.05),TRX1、Nrf1 mRNA显著升高(P<0.05);与HFG组相比,HFG+TXNIP(+)组细胞TXNIP、Akt、MAPK mRNA水平显著升高(P<0.05),TRX1、Nrf1显著降低(P<0.05)。7.2 TXNIP、TRX1、Nrf1、Akt、p-Akt、MAPK、p-MAPK的蛋白水平与ND组相比,HFD组细胞中TXNIP、Akt、MAPK蛋白表达显著升高(P<0.05),TRX1、Nrf1、p-Akt、p-MAPK蛋白表达显著降低(P<0.05);与HFD组相比,HFG组及HFD+TXNIP(-)组细胞中TXNIP、Akt、MAPK蛋白表达均显著降低(P<0.05),TRX1、Nrf1、p-Akt、p-MAPK蛋白表达均显著升高(P<0.05);与HFG组相比,HFG+TXNIP(+)组细胞TXNIP、Akt、MAPK蛋白表达水平显著升高(P<0.05),TRX1、Nrf1、p-Akt、p-MAPK蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。小结:1.Ex-4调控TRX/TXNIP的表达水平,改善骨骼肌脂质沉积及线粒体氧化应激反应。2.Ex-4调控Nrf1/2、Akt、MAPK信号通路调节骨骼肌糖原合成和脂肪酸氧化,从而改善高果糖诱导的L6细胞胰岛素抵抗。第四部分不同糖耐量人群血清TXNIP水平与胰岛功能及氧化应激指标的相关性目的:比较不同糖耐量人群TXNIP水平的变化,进一步探讨TXNIP与胰岛功能及氧化应激水平的相关性。方法:选取2018年1月至2018年7月在河北省人民医院内分泌科参加糖尿病筛查的志愿者151人。受试者知情同意后,行口服葡萄糖耐量试验,按空腹血糖及餐后2小时血糖水平分为三组,分别为糖耐量正常组(normal glucose tolerance,NGT,空腹血糖<6.1mmol/L,餐后2h血糖<7.8mmol/L)、糖调节受损组(impaired glucose regulation,IGR,空腹血糖6.1～6.9mmol/L,或餐后2h血糖7.8～11.0mmol/L)以及2型糖尿病组(diabetes mellitus,T2DM,空腹血糖≥7.0mmol/L和(或)餐后2h血糖≥11.1mmol/L)。检测3组患者硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、胰岛功能、氧化应激指标丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶T-SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)的水平,分析TXNIP与胰岛功能、氧化应激相关指标的相关性。结果:1.三组一般资料年龄、性别、体重、身高、BMI差异没有统计学意义(P>0.05),与NGT组相比,IGR组、T2DM组TC、TG、LDL-C、FINS、HOMA-β、HOMA-IR有统计学差异(P<0.05)。2.T2DM、IGR组TXNIP水平高于NGT组,T2DM高于IGR组,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.T2DM、IGR组胰岛素抵抗指数高于NGT组,胰岛β细胞功能指数低于NGPearson相关性分析表明,TXNIP水平与胰岛素抵抗指数成正相关,与胰岛β细胞功能呈负相关,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.T2DM、IGR组MDA水平高于NGT组,T-SOD、GSH-Px、CAT水平低于NGT组,差异均有统计学意义(P<0.05)。T2DM组T-SOD、GSH-Px、CAT水平低于IGR组,差异均有统计学意义(P<0.05),T2DM组MDA水平高于IGR组,差异均有统计学意义(P<0.05)。5.Pearson相关性分析表明,TXNIP水平与胰岛素抵抗指数成正相关,与胰岛β细胞功能呈负相关(P<0.05)。6.Pearson相关性分析表明,TXNIP水平与MDA成正相关,与T-SOD、GSH-Px和CAT呈负相关(P<0.05)。小结:1.血清TXNIP水平与糖代谢紊乱密切相关,随病情发展而升高;同事伴随氧化应激指标的变化。2.TXNIP水平与胰岛素抵抗指数成正相关,与胰岛β细胞功能呈负相关。3.血清TXNIP水平与糖代谢异常患者体内氧化应激水平相关。结论:1.高果糖饮食可以诱导大鼠出现血脂紊乱、骨骼肌脂质沉积,骨骼肌细胞内出现糖脂代谢障碍,导致胰岛素抵抗。2.GLP-1受体激动剂Ex-4可以改善骨骼肌脂质沉积;调控Nrf1、Akt、MAPK信号通路及相关基因和蛋白的表达调节骨骼肌糖脂代谢和线粒体氧化应激,从而改善高果糖诱导的胰岛素抵抗。3.TRX/TXNIP是GLP-1受体激动剂Ex-4调控骨骼肌线粒体氧化应激的重要靶点。4.血清TXNIP水平与胰岛素抵抗及糖代谢紊乱患者体内氧化应激水平密切相关。