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背景外泌体（exosomes）是几乎所有细胞都可以分泌的一种小囊泡。骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem cells,BMSCs）所分泌的外泌体具有调节炎症反应,抗凋亡以及促进血管生成等作用,可促进受损心脏的修复。但现有的移植方式无法使外泌体在心脏部位持续的发生作用。如何能够更加高效、精准的使外泌体作用于心脏,是目前研究的热点之一。心包腔以其独特的解剖学特点为治疗方式提供了新的思路。向心包腔内注射外泌体是否能够起到持续的缓释作用,以改善心脏功能,目前尚缺乏实验研究。目的探讨骨髓间充质干细胞来源的外泌体经心包腔注射后能否高效的进入心脏组织并对大鼠慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure,CHF）起治疗作用,为临床慢性心力衰竭的治疗提供新的方式。方法1.选2周龄SD大鼠,采用颈椎脱臼法处死后,浸泡入75%酒精中消毒,无菌条件下快速分离出其双下肢股骨和胫骨。冲洗骨髓腔,采用密度梯度离心法分离纯化,培养BMSCs。培养至第三代后用免疫荧光染色技术对BMSCs进行鉴定。选择的间充质干细胞标志物有CD29、CD44和CD90。2.将所分离纯化的BMSCs培养至第三代后,待细胞密度至80%左右,换用含有无外泌体血清的完全培养基培养48小时。收集细胞培养上清,通过差速超高速离心的方法获得外泌体。分别用透射电镜、蛋白质免疫印迹和纳米微粒追踪分析（NTA）来观察外泌体的形态,检测外泌体蛋白标志物（CD9、CD63、Alix、GM130）,分析外泌体的粒径和浓度。3.利用BCA法检测外泌体浓度,并将外泌体悬液分为0、50、100、150、200μg/ml五组。将大鼠H9C2细胞接种至96孔板内,并将不同浓度的外泌体分别与大鼠H9C2细胞共培养24h和48h。利用细胞计数试剂盒检测不同组细胞的增殖情况。4.将大鼠H9C2细胞接种至96孔板内,培养一段时间后加入盐酸多柔比星溶液。分为对照组、PBS组、外泌体组。对照组不加任何试剂,PBS组和外泌体组分别加入等体积的无菌PBS和外泌体悬液。共同培养24h和48h,利用细胞计数试剂盒检测外泌体是否对细胞有保护作用。5.选择6-8周龄SD大鼠55只,常规饲养两周后,采用经腹腔注射盐酸多柔比星的方式来构建心衰模型。将其分为心衰组（HF）、外泌体组（exo）、假手术组（sham）各15只。心衰组不进行心包腔注射,外泌体组心包腔内注射外泌体悬液,假手术组心包腔内注射生理盐水。对照组（ctrl）10只,腹腔内注射等体积的生理盐水。利用小动物心脏超声检测大鼠的心脏功能,以大鼠左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）＜50%作为造模成功的标准。6.造模成功后,将经过鉴定的外泌体悬液注射至大鼠心包腔内,利用小动物活体成像仪判断所注射的外泌体是否存在于心包腔内。心脏组织切片观察外泌体是否透过心外膜进入到心脏组织中。7.术后第十天分别对每组大鼠进行心脏超声检测。根据大鼠心脏左室长轴切面M型超声的左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左室缩短率（left ventricular fractional shortening,LVFS）和心输出量（Cardiac output,CO）检测心脏功能。8.分别取四组大鼠的心脏组织,冰冻切片。采用免疫组织化学染色技术检测各组大鼠心脏组织中脑钠肽（BNP）、白细胞介素6（IL-6）的表达情况;采用免疫荧光染色技术检测各组大鼠心脏组织中的血小板-内皮细胞粘附分子（CD31）和血管内皮生长因子A（VEGFA）的表达情况;利用Masson染色技术检测各组大鼠心脏组织中胶原纤维的含量。结果1.光学显微镜下,大鼠下肢长骨骨髓腔内提取的BMSCs呈漩涡状或鱼群样生长。免疫荧光结果显示:细胞表达间充质干细胞标志物CD90、CD44和CD29,不表达CD45。免疫荧光双重染色结果显示:所提取细胞中,CD29和CD44共同表达,CD44和CD90共同表达。2.透射电镜显示:差速加超高速离心分离出的小囊泡呈双层囊膜结构,直径大多分布在30-150nm;纳米微粒追踪分析显示,悬液中微粒直径在126.3nm处达到峰值;蛋白免疫印迹检测CD9、CD63、Alix表达为阳性,GM130为阴性。3.细胞增殖实验显示:不同浓度的外泌体与大鼠H9C2细胞共培养24h和48h后均能够促进细胞的增殖,其中100μg/ml的外泌体促进增殖作用最强（P＜0.05）。4.细胞计数实验显示:100μg/ml的外泌体能够保护盐酸多柔比星造成的H9C2细胞损伤（P＜0.01）。5.心脏超声观察:经腹腔注盐酸多柔比星溶液6周后,心衰造模组的左室射血分数（LVEF）有明显降低或低于50%（P＜0.01）,对照组心功能无明显变化。经心包腔注射外泌体后,外泌体组的LVEF、LVFS和CO较手术前均有所增加（P＜0.01）。假手术组和HF组手术前后心功能无明显变化。6.小动物活体成像结果显示:经心包腔注射7天后大鼠胸腔内心脏体表投影的位置存在强度较高的荧光信号;心脏组织切片观察显示:外泌体透过心外膜进入到心肌层内。7.免疫组织化学染色结果显示:与对照组相比,外泌体组、假手术组和HF组心肌组织内BNP含量均有所升高,具有统计学意义（P＜0.01）。其中外泌体组心脏组织中BNP的含量又明显低于假手术组和HF组,具有显著性差异（P＜0.001）;对照组和外泌体组大鼠心脏组织内IL-6的含量低于HF组和假手术组,具有显著统计学意义（P＜0.001）。对照组与外泌体组相比无统计学差异（P＞0.05）。8.组织免疫荧光染色结果显示:与对照组相比,外泌体组心肌组织中CD31的含量升高,具有统计学意义（P＜0.01）。同时,外泌体组CD31的含量也高于假手术组和HF组（P＜0.05）,假手术组、HF组与对照组相比无统计学差异（P＞0.05）;对照组和外泌体组VEGFA表达量高于HF组和假手术组,具有显著性差异（P＜0.001）。对照组和外泌体组相比无统计学意义（P＞0.05）。9.Masson染色结果显示:假手术组和HF组大鼠心肌组织中胶原纤维含量较高。外泌体组胶原纤维含量明显低于假手术组和HF组,具有显著统计学差异（P＜0.001）。外泌体组于对照组之间无统计学差异（P＞0.05）。结论经心包腔注射骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以透过心外膜进入心脏组织,对心力衰竭心脏起到抗炎、促进血管新生、改善心脏功能、减轻心脏重塑的作用。