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目的:通过外周血炎症细胞因子及HCAR1、MHCⅡ相关信号传导通路的改变,来了解调控HCAR1介导的以MHCⅡ下调为主的免疫反应对脂肪间充质干细胞（ADSCs）移植治疗脓毒症的作用,为治疗脓毒症提供新思路。方法:1.临床实验:研究对象为脓毒症组（Sepsis组）及健康对照组（NS组）各20例,Sepsis组于入院第1天、NS组于体检当时留取外周血,荧光定量RT-PCR法检测脓毒症外周血有核细胞总RNA中HCAR1、MHCⅡ、TLR4和NLRP3 m RNA的表达;酶联免疫吸附试验法（ELISA）法检测脓毒症外周血清细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-10及IL-18的表达。2.动物实验:首先体外培养大鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）,使用CD90、CD44、CD35和CD45对大鼠脂肪间充质干细胞进行免疫荧光鉴定,之后使用含有GFP荧光蛋白基因的慢病毒转染细胞,使细胞被GFP荧光标记备用;随机选用SD雄性大鼠分为5组,（1）正常对照组（NC组）（2）脓毒症模型组（LPS组）（3）脂肪间充质干细胞移植组（L+M组）（4）合并HCAR1受体激动剂组（L+Gi+M组）（5）合并HCAR1受体抑制剂组（L+Gk+M组）,每组各6只。脓毒症模型建立:以5mg/kg剂量向（2）（3）（4）（5）组大鼠腹腔注射LPS,建立脓毒模型;30min以后向（3）组大鼠尾静脉注射200ul（1x106cell/ml）ADSCs;向（4）（5）组大鼠按30mg/kg剂量腹腔注射HCAR1受体激动剂和抑制剂,观察1小时后,再向（4）（5）组大鼠尾静脉注射200ul（1x106cell/ml）ADSCs;于模型建立第3天,10%苯巴比妥浅麻醉后活体成像荧光示踪;然后对各组剩余大鼠麻醉解剖,留取肺组织首先行快速冰冻切片,HE染色观察各组显微镜下病理改变,激光共聚焦成像观察细胞荧光定位情况,随后使用酶联免疫吸附ELISA法检测外周血炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10及IL-18的表达量;荧光定量RT-PCR法检测HCAR1、MHCⅡ、TLR4和NLRP3mRNA的表达;蛋白免疫印迹法Western blot法检测HCAR1、MHCⅡ、TLR4和NLRP3蛋白的表达情况。结果:1、临床实验:通过对健康体检者和脓毒症患者血液样本进行检测RT-PCR法验证基因差异性表达发现Sepsis组各患者外周血HCAR1mRNA的表达量（7.06±2.18）较NS组表达量（10.7±3.13）均显著下降（t=4.24,P<0.05）,而Sepsis组中MHCⅡ、TLR4和NLRP3等m RNA的表达量[分别为（9.19±1.90）、（11.7±2.69）及（5.98±1.58）]较NS组表达量[分别为（7.40±1.97）、（8.33±1.95）及（3.60±0.937）]均显著增高（t分别为2.91、4.49及5.81,P<0.05）。ELISA法验证血清中IL-1β、TNF-α、IL-10及IL-18等细胞因子的差异性表达发现Sepsis组各患者外周血中IL-1β、IL-18、TNF-α及IL-10细胞因子的表达量[分别为（71.7±7.16）、（97.7±8.16）、（94.7±16.0）及（25.4±4.73）pg/ml]较NS组表达量[分别为（64.8±6.47）、（84.9±9.51）、（73.4±4.15）及（21.2±5.05）pg/ml]均显著升高（t分别为3.19、4.56、5.79及2.72,P<0.05）。绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析发现在HCAR1、TLR4、MHCⅡ及NLRP3 m RNA表达中外周血HCAR1、TLR4、MHCⅡ及NLRP3的ROC曲线下面积（AUC）分别为:0.830、0.853、0.735及0.945,基因检测方面NLRP3的诊断价值最优;而外周血清IL-1β、IL-18、TNF-α及IL-10的ROC曲线下面积（AUC）分别为:0.751、0.841、0.924及0.729,细胞因子检测方面TNF-α的诊断价值最优。进一步相关性分析发现信号调节关键分子HCAR1与TLR4、MHCⅡ及NLRP3 m RNA表达呈负相关（r值分别为:-0.666、-0.587及-0.621,P<0.05）;而炎症反应信号通路TLR4与下游NLRP3及IL-1β、IL-18、TNF-α等炎症因子表达呈正相关（r值分别为:0.641、0.666、0.624及0.606,P<0.05）。2、动物实验:我们成功培养了大鼠脂肪间充质干细胞,并用GFP荧光蛋白稳定标记细胞备用。同时我们成功构建了脓毒症、干细胞移植、干细胞移植合并HCAR1受体激动剂和抑制剂等各组别动物模型。首先观察大鼠脂肪间充质干细胞GFP慢病毒标记活体荧光示踪,证明ADSCs移植后可经血液循环定植于肺脏;然后对各组大鼠肺组织行冰冻切片后行激光共聚焦荧光成像,以GFP荧光量粗观测ADSCs移植后肺内定植数目,发现LPS组与NC组无脂肪间充质干细胞移植;L+M组与LPS组对比显示肺组织内有绿色荧光标记的间充质干细胞分布;L+Gi+M组与L+M组对比显示肺组织内绿色荧光标记的间充质干细胞数目增多;L+Gk+M组与L+Gi+M组及L+M组对比肺组织内荧光标记干细胞数目和分布明显下降,各组之间存在差异;后对各组大鼠肺组织内GFP蛋白行Western blot实验检测发现:NC组及LPS组确无GFP蛋白表达,其余各组均可检测到GFP蛋白差异性表达,L+Gi+M组（0.849±0.148）较L+M组（0.582±0.124）呈明显高水平表达（t=3.38,P<0.05）;L+Gk+M组（0.332±0.0747）较L+Gi+M组及L+M组均呈低水平表达（t=7.64及4.24,P<0.05）。后对各组大鼠肺组织行切片HE染色发现LPS组与NC组对比显示出现弥漫性的肺泡损伤改变;L+M组与LPS组对比显示充血水肿有所减轻,肺泡腔及肺间质结构局部完整可见;L+Gi+M组与L+M组及LPS组对比显示炎症细胞浸润明显减少,未见明显充血水肿,肺泡及肺间质等结构清晰;L+Gk+M组与L+Gi+M组及L+M组对比显示炎症细胞浸润明显增多,可见充血水肿,肺泡及肺间质等结构部分清晰,但较LPS组病理损伤程度弱。通过对各组模型大鼠血液样本进行RT-PCR法验证基因差异性表达发现HCAR1受体m RNA相对表达量比较:LPS组（3.09±0.977）较NC组（6.09±0.539）表达明显降低（t=6.60,P<0.05）;L+M组（9.66±1.40）与LPS组相比表达明显增高（t=9.45,P<0.05）;L+Gi+M组（14.3±2.07）较L+M组及NC组均呈高水平表达（t=4.58及9.43,P<0.05）;L+Gk+M组（8.39±1.48）较L+Gi+M组表达呈明显降低,但仍高于LPS组（t=5.73及7.33,P<0.05）,较L+M组表达有所下降,但差异无明显统计学意义（t=1.53,P>0.05）。TLR4、MHCⅡ及NLRP3 m RNA相对表达量比较:LPS组[（24.8±3.18）、（17.4±2.23）及（15.0±1.93）]较NC组[（6.26±0.544）、（4.34±0.383）及（3.91±0.346）]表达显著增高[检验值分别为（t=14.1、14.1及13.9,P<0.05）];L+M组[（17.1±1.53）、（11.5±1.03）及（9.56±0.854）]较LPS组表达有所下降[检验值分别为（t=5.32、5.85及t=6.36,P<0.05）];L+Gi+M组[（12.3±1.78）、（9.52±1.38）及（7.37±1.07）]较L+M组呈明显低水平表达,但仍高于NC组表达[检验值分别为（t=5.02及7.95,P<0.05）、（t=2.85及8.89,P<0.05）及（t=3.93及7.57,P<0.05）];L+Gk+M组[（20.1±2.15）、（13.5±1.44）及（11.7±1.25）]较L+Gi+M组表达呈明显增高,但仍低于LPS组表达[检验值分别为（t=6.88及2.96,P<0.05）、（t=4.86及3.62,P<0.05）及（t=6.50及3.53,P<0.05）],同时较L+M组仍呈高水平表达[检验值分别为（t=2.81、2.70及3.51,P<0.05）]。进一步对各组模型大鼠肺组织样本行RT-PCR法验证基因差异性表达,发现HCAR1受体m RNA相对表达量比较:LPS组（3.02±0.770）较NC组（5.65±0.499）表达明显降低（t=7.00,P<0.05）;L+M组（8.96±1.08）与LPS组相比明显增高（t=11.0,P<0.05）;L+Gi+M组（13.8±2.00）较L+M组及NC组均呈高水平表达（t=5.27及9.74,P<0.05）;L+Gk+M组（7.83±1.38）较L+Gi+M组表达呈明显降低,但仍高于LPS组（t=6.07及7.45,P<0.05）,同时较L+M组表达有所下降,差异无统计学意义（t=1.59,P>0.05）。TLR4、MHCⅡ及NLRP3 m RNA相对表达量比较:LPS组[（18.8±2.41）、（11.8±1.52）及（12.7±1.63）]较NC组[4.95±0.437)、（3.16±0.280）及（5.33±0.471）]表达明显增高[检验值分别为（t=13.8、13.8及10.6,P<0.05）];L+M组[（13.4±1.20）、（8.32±0.743）及（9.17±0.819）]较LPS组表达有所下降[检验值分别为（t=4.87、5.09及4.75,P<0.05）];L+Gi+M组[（9.20±1.33）、（6.62±0.957）及（6.65±0.585）]较L+M组呈明显低水平表达,但仍高于NC组表达[检验值分别为（t=5.78及7.44,P<0.05）、（t=3.44及8.50,P<0.05）及（t=6.14及4.30,P<0.05）];L+Gk+M组[（15.7±1.67）、（10.0±1.07）及（10.8±1.15）]较L+Gi+M组表达呈明显增高,但仍低于LPS组表达[检验值分别为（t=7.44及2.57,P<0.05）、（t=5.83及2.37,P<0.05）及（t=7.90及2.32,P<0.05）],同时较L+M组仍呈高水平表达[检验值分别为（t=2.70、3.23及2.85,P<0.05）]。后对各组模型大鼠肺组织样本行Western blot法验证蛋白差异性表达发现HCAR1受体蛋白相对表达量比较:LPS组（0.187±0.0460）较NC组（0.541±0.127）表达明显降低（t=6.44,P<0.05）;L+M组（1.00±0.225）与LPS组相比明显增高（t=8.67,P<0.05）;L+Gi+M组（1.34±0.289）较L+M组及NC组均呈高水平表达（t=2.30及6.22,P<0.05）;L+Gk+M组（0.854±0.197）较L+Gi+M组表达呈明显降低,但仍高于LPS组（t=3.43及8.10,P<0.05）,同时较L+M组表达有所下降,但差异未见明显统计学意义（t=1.19,P>0.05）。TLR4、MHCⅡ及NLRP3蛋白相对表达量比较:LPS组[（1.17±0.234）、（1.38±0.307）及（1.26±0.243）]较NC组[（0.258±0.0576）、（0.293±0.0513）及（0.201±0.0344）]表达明显增高[检验值分别为（t=9.31、8.54及10.6,P<0.05）];L+M组[（0.683±0.0957）、（0.811±0.198）及（0.760±0.174）]较LPS组表达有所下降[检验值分别为（t=4.76、3.81及4.09,P<0.05）];L+Gi+M组[（0.437±0.0933）、（0.573±0.145）及（0.410±0.0788）]较L+M组呈明显低水平表达,但仍高于NC组表达[检验值分别为（t=4.50及4.01,P<0.05）、（t=2.38、及4.47,P<0.05）及（t=4.48及5.96,P<0.05）];L+Gk+M组[（0.860±0.115）、（1.05±0.127）及（0.982±0.167）]较L+Gi+M组表达呈明显增高,但仍低于LPS组表达[检验值分别为（t=7.00及2.95,P<0.05）、（t=6.06及2.44,P<0.05）及（t=7.59及2.30,P<0.05）],同时较L+M组仍呈高水平表达[检验值分别为（t=2.91、2.47及2.26,P<0.05）]。我们进一步使用ELISA法检测细胞因子发现IL-1β、IL-18及TNF-α细胞因子表达量比较:LPS组[（30.2±2.44）、（83.9±6.28）及（140±12.6）pg/ml]较NC组[（6.81±0.585）、（34.3±2.09）及（21.7±3.15）pg/ml]表达显著增高[检验值分别为（t=22.9、18.4及22.3,P<0.05）];L+M组[（21.0±1.75）、（63.5±5.58）及（91.3±11.6）pg/ml]较LPS组明显降低[检验值分别为（t=7.54、5.95及7.01,P<0.05）];L+Gi+M组[（12.6±1.64）、（41.8±5.73）及（67.6±13.8）pg/ml]较L+M组呈低水平表达,仍较NC组呈高水平表达[检验值分别为（t=8.58及8.14,P<0.05）、（t=6.63及3.03,P<0.05）及（t=3.21及7.96,P<0.05）];L+Gk+M组[（24.5±1.57）、（71.9±4.72）及（111±9.66）pg/ml]较L+Gi+M组、L+M组表达呈明显增高,但低于LPS组表达[检验值分别为（t=12.8、3.58及4.89,P<0.05）、（t=9.94、2.84及3.72,P<0.05）及（t=6.24、3.12及4.61,P<0.05）]。IL-10细胞因子表达量比较:LPS组（10.4±1.44）pg/ml较NC组（5.76±1.55）pg/ml表达明显增高（t=5.41,P<0.05）;L+M组（15.5±1.28）pg/ml较LPS组明显升高（t=6.39,P<0.05）;L+Gi+M组（23.7±2.83）pg/ml较L+M组及NC组均呈高水平表达（t=6.48及13.6,P<0.05）;L+Gk+M组（13.1±0.493）pg/ml较L+Gi+M组、L+M组表达呈明显下降,但仍高于LPS组表达（t=8.97、4.13及4.38,P<0.05）。对大鼠外周血m RNA相关因子行相关性分析发现LPS组、L+M组、L+Gi+M组及L+Gk+M组中HCAR1的表达与TLR4（r分别为:-0.840、-0.814、-0.854及-0.843）、MHCⅡ（r分别为:-0.813、-0.824、-0.875及-0.860）和NLRP3（r值分别为:-0.867、-0.837、-0.828及-0.862）的表达在m RNA水平均呈负相关（P均<0.05）。同时大鼠肺组织m RNA相关因子行相关性分析发现在上诉各组中HCAR1的表达与TLR4（r值分别为:-0.821、-0.853、-0.854及-0.862）、MHCⅡ（r值分别为:-0.872、-0.847、-0.814及-0.862）和NLRP3（r值分别为:-0.831、-0.915、-0.925及-0.859）的表达在m RNA水平也均呈负相关（P均<0.05）。而对大鼠肺组织蛋白相关因子相关性分析发现HCAR1的表达与TLR4（r值分别为:-0.876、-0.830、-0.861及-0.901）、MHCⅡ（r值分别为:-0.815、-0.899、-0.922及-0.845）和NLRP3（r值分别为:-0.884、-0.848、-0.893及-0.872）的表达在蛋白水平依旧呈明显负相关（P均<0.05）。结论:临床水平:1、脓毒症状态下细胞因子IL-1β、IL-18、IL-10、TNF-α的表达明显增高;外周血MHCII、TLR4和NLRP3基因及表达明显增高,且TLR4与NLRP3、IL-1β、IL-18、TNF-α等细胞因子表达呈明显正相关;而HCAR1基因表达明显减少,且HCAR1与MHCⅡ、TLR4和NLRP3呈明显负相关,表明脓毒症状态下TLR4/NLRP3炎症反应信号通路激活释放大量炎症因子,伴随着HCAR1表达下调,MHCⅡ作用增强加剧炎症反应。2、通过ROC曲线下面积分析发现基因检测NLRP3和ELISA检测TNF-α细胞因子表达可成为脓毒症优选诊断标志。动物水平:1、脂肪间充质干细胞（ADSCs）移植可以部分减少MHCⅡ、TLR4和NLRP3以及IL-1β、IL-18、TNF-α的表达,上调HCAR1和抗炎因子IL-10的表达;且HCAR1与MHCⅡ、TLR4和NLRP3呈明显负相关,表明脂肪间充质干细胞可能通过抑制TLR4信号通路减弱,一方面直接抑制炎症反应,另一方面减弱对HCAR1表达的抑制,调节了MHCⅡ介导的异体排斥作用,增加干细胞移植率,更好的发挥抗炎作用。2、使用HCAR1激动剂后ADSCs移植较单独ADSCs移植可以明显抑制MHCⅡ、TLR4和NLRP3以及IL-1β、IL-18、TNF-α的表达,而HCAR1和抗炎因子IL-10的表达明显增高,且HCAR1与MHCⅡ、TLR4和NLRP3仍呈明显负相关,说明HCAR1表达增加或作用增强可能通过进一步下调MHCⅡ介导的异体排斥作用,明显增加干细胞移植率及抑炎治疗效果。但使用HCAR1受体抑制剂处理后进行ADSCs移植可以明显抑制受体功能并逆转上述抑炎效应,说明调节HCAR1受体表达对间充质干细胞移植治疗脓毒症有增效作用。