背景和目的食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,我国占全球病例的一半以上,食管鳞癌是其主要类型（90%以上）。目前,早期手术切除是提高患者存活率最有效的方法,但因它在进展或转移之前很难被发现,故放化疗是最合适的选择,而事实证明,接受放化疗治疗的大多数患者的生存情况仍然不佳。虽然现在诊疗措施不断完善,食管癌死亡率有所下降,但患者预后仍然较差,5年生存率仅为10%-25%。为了改善我国食管癌患者的总体生存和预后情况,针对食管癌靶向治疗的临床前和临床研究亟待开展。“协同致死”效应是基于“Knudson”二次打击学说而发展的肿瘤治疗新策略。在肿瘤细胞中,当某一条DNA损伤修复通路发生异常,细胞会依赖其补偿通路而存活,在此基础上阻断其补偿通路就会导致细胞死亡。带有叉头相关结构域和环指结构域的检查点（Checkpoint with fork-head associated and ring finger,CHFR）位于人类第12号染色体长臂2区4带3亚带,是一种具有肿瘤抑制功能的有丝分裂检查点蛋白。到目前为止,越来越多的研究报道肿瘤抑制基因的丢失通常由表观遗传学异常改变引起,包括DNA甲基化。正常基因甲基化在胚胎发育、细胞分化以及基因组稳定性等多方面发挥重要作用,然而异常的DNA甲基化很可能诱导肿瘤的发生。目前,针对DNA损伤修复（DNA damage repair,DDR）基因表观遗传学异常作为肿瘤治疗策略的研究较少,本课题旨在探究CHFR在食管癌细胞中参与DNA损伤修复的机制及应用“协同致死”新策略治疗食管癌的可能性。“协同致死”关系的筛选和正确利用不但可以拓宽和加速抗肿瘤药物靶标的发现,在未来甚至可以解决在肿瘤治疗中的一系列难题。方法本课题采用了半定量RT-PCR、甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）技术分析CHFR在7种食管癌细胞株中的表达是否受甲基化调控。通过MSP技术检测1008例原发食管癌组织中CHFR的甲基化率。将食管癌组织中CHFR的甲基化状态与临床病理相关资料进行统计学分析,并对其中576例有随访资料的病例进行生存分析。通过慢病毒感染技术构建CHFR稳定表达细胞模型,利用CRISPR-Cas9技术构建CHFR稳定敲除细胞模型,应用MTT、western blot等实验阐明CHFR在食管癌中的作用机制,探究CHFR甲基化能否成为食管癌“协同致死”治疗的标记物。结果1.CHFR在食管癌细胞中的表达受基因启动子区甲基化调控,CHFR在KYSE30、KYSE140、KYSE450中正常表达,基因启动子区呈现非甲基化状态;CHFR在KYSE70中表达减少,基因启动子区呈现部分甲基化状态;CHFR在KYSE150、KYSE410、KYSE510中表达缺失,基因启动子区呈现完全甲基化状态。2.CHFR在正常食管组织中不发生甲基化（0/13）,在原发食管癌组织中的甲基化率达61.9%（624/1008）。食管癌中CHFR的甲基化状态与患者的性别（p﹤0.01）、吸烟情况（p﹤0.01）、饮酒情况（p﹤0.05）及肿瘤的分化程度相关（p﹤0.05）,与年龄、家族史、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、脉管癌栓等因素无关（p﹥0.05）。3.在食管癌细胞中,CHFR基因在大剂量多西他赛（5 n M）诱导下能抑制同源重组（Homologous Recombination,HR）修复通路并激活非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）修复通路进而影响细胞存活,这种作用不依赖于DNA损伤且可能是通过抑制丝氨酸苏氨酸激酶15（Aurora kinase A,AURKA）的表达实现的。4.在食管癌细胞中,CHFR基因在小剂量多西他赛（0.5 n M）诱导DNA损伤的前提下激活了HR修复通路,且CHFR恢复表达后对ATM抑制剂敏感。结论CHFR基因在食管癌中的表达受甲基化调控,它可在大剂量多西他赛（5 n M）诱导下通过抑制HR信号通路、激活NHEJ信号通路而影响细胞存活,且此作用不依赖于DNA损伤。在小剂量多西他赛（0.5 n M）诱导DNA损伤的前提下激活HR通路,且CHFR恢复表达后对ATM抑制剂敏感。