等温核酸扩增技术是在固定温度下于体外扩增单链引物的核酸扩增方法。等温核酸扩增技术完全消除了热循环装置的要求,因此显著简化了现场实时使用程序。等温核酸扩增技术比聚合酶链式反应(PCR)更经济、更容易使用,并且更耐受原始样品中的成分抑制。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是一种无模板DNA聚合酶,可以添加脱氧核苷三磷酸(dNTP)到单链DNA的3’-OH末端。TdT经常用于等温核酸扩增中将核苷酸添加到单个引物的3’-OH末端。TdT等温核酸扩增比PCR更方便,因为PCR需要高纯度引物,复杂的热循环变性和退火,其中聚合酶容易被样品中的热不稳定组分灭活。随着科学技术的进步,等温核酸扩增已经被广of 泛应用与各个研究领域,包括疾病标志物的分析、有机小分子的检测、氨基酸和多肽及蛋白质的分析、核酸分子的分析、金属离子的检测等,其在分析科学中显示出很好的应用前景。基于此,本文开展了以下工作:1.利用胸腺嘧啶与Hg2+特异性结合形成T-Hg2+-T错配双螺旋结构,并且借助于TdT等温核酸扩增的优点,发展了一种无标记的荧光分析方法用于Hg2+的检测。TdT识别引物的3’-OH末端,随后在脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的帮助下延长引物的3’-OH端。产生的产物与铜离子配位形成DNA模板化的铜纳米簇(CuNCs),并产生强烈的荧光。Hg2+的引入使得引物形成T-Hg2+-T错配双螺旋结构,其阻止了 TdT捕获3’-OH末端。导致了引物的延长反应暂停,因此CuNCs不能被有效的合成,进而导致荧光猝灭。该传感方法检测汞离子的线性范围为200 pM～500 nM,最低检测限为0.076 nM(S/N=3),并且该方法不需要洗涤和分离,具有较好的选择性,对实际样品中汞离子的分析具有十分重要的运用价值。2.利用聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(poly-T)和L-半胱氨酸对汞离子的竞争性反应,构建了一种基于T-Hg2+-T错配双螺旋结构用于L-半胱氨酸的荧光分析方法。首先,聚胸腺嘧啶的单链DNA可以和汞离子形成T-Hg2+-T错配双螺旋结构,而Sybr Green I(SG)可以嵌入到T-Hg2+。-T错配双螺旋结构,并且在合适的激发波长下会发出强烈的荧光。当加入L-半胱氨酸时,L-半胱氨酸会夺取T-Hg2+-T错配双螺旋结构中的汞离子,导致SG从T-Hg2+-T错配双螺旋结构中脱落,并伴随着荧光熄灭。该方法对L-半胱氨酸的线性范围为10 nM～500 nM,最低检出限为7.4 nM(S/N=3)。该方法操作简便,灵敏度好,对实际样品中L-半胱氨酸的检测具有较好的可行性。3.由于三聚氰胺(Me)可以和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸形成三重氢键(T-Me-T),在工作2的基础之上,本工作构建了一种荧光增强的方法用于三聚氰胺特异性检测。L-半胱氨酸可以夺取T-Hg2+-T错配双螺旋结构中的汞离子,导致T-Hg2+-T错配双螺旋结构解体形成游离的poly-T单链DNA。当加入三聚氰胺时,三聚氰胺会和游离的poly-T单链DNA形成三重氢键(T-Me-T)。此时SG可以嵌入到T-Me-T结构中,从而产生强烈的荧光信号。本文利用L-半胱氨酸巧妙地将T-Hg2+-T错配双螺旋结构和T-Me-T三重氢键联系了起来,实现了对三聚氰胺的特异性检测。在该方法中,三聚氰胺的浓度在50 nM～5000nM时具有良好的线性关系,经计算得出的检测限为14nM(S/N=3),低于国家标准(8 μM)。该方法无需标记,操作简单,可以为食品中三聚氰胺的检测提供参考依据。