研究目的支气管哮喘是一种复杂的疾病，以气道炎症反应、气道高反应性以及气道重塑为特征。而气道血管的再生与重塑在支气管哮喘气道重塑当中起着尤为重要的作用。在血管再生和重塑过程中，生长因子如血管内皮细胞生长因子（VEGF）及血小板源生长因子（PDGF）等起着重要的作用，VEGF增加的结果是使血管渗透性和水肿进一步恶化，促进血管再生。而缺乏PDGFB会导致壁细胞募集不充分，从而影响内皮细胞生长，渗透性，脆性改变，血管扩张，出血，灌注损伤以及缺氧。对这些方面的进一步研究将对支气管哮喘的防治提供新的研究方向。本试验将详细阐明支气管哮喘气道血管特异性改变以及血管再生和重塑相关影响因子的作用。材料与方法1、小鼠支气管哮喘模型的制备：雄性清洁级A/J小鼠30只，5周大，分成三组，A组：正常对照组；B组：急性早期支气管哮喘组；C组：慢性延长期支气管哮喘组。每组10只，试验开始0，28，42，56天B组C组小鼠分别给予10ug卵清蛋白（ovalbumin，OVA）+2mg氢氧化铝凝胶腹膜内注射，之后，应用超生雾化装置（3ml/min）进行OVA雾化（20mg/ml），B组每日一次，共1周，C组每日一次共5周，A组吸入0.9％生理盐水。2、气道反应性检测：最后一次吸入OVA24小时后开始检测气道反应性。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将小鼠放到全身体积描记仪（Buxco Electronics，Troy，NY）上检测气道阻力（Raw），测得的数据表示为Raw百分数，用下面的公式得出：（吸入Ach之后的Raw/吸入之前的Raw）×100％。3、血管灌注，小鼠处死，留取血清，肺泡灌洗液和肺组织肺泡灌洗液细胞成份计数。ELISA法检测血清总IgE和OVA特异性IgE水平及肺泡灌洗液IL-4，IL-5水平。4、冰冻切片HE染色及免疫荧光染色冰冻肺组织于冰冻切片机上切片（4—6um），进行HE染色，于光镜下观察并照相。简述双重及三重免疫荧光染色过程如下：冰冻切片冰丙酮固定10分钟，0.01MPBS洗片后加正常10％羊血清（Sigma，MO，USA）室温20分钟，一抗4℃孵育过夜，0.01PBS洗片后加二抗室温2小时，0.01PBS洗片后甘油封片。三重染色时二抗室温2小时0.01PBS洗片后加TOTO-3（1：10000）核染，室温30分钟，0.01PBS洗片后甘油封片。应用激光共聚焦显微镜（model TC-SP，Leica，Heidelberg，Germany）观察表达，照相。5、逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测VEGF/VEGFR和PDGFB/PDGFRβ基因表达应用RNeasy Mini Kit（Qiagen；Hilden，Germany）从气管及肺组织中提取总RNA，每个标本取相同质量的总RNA 2ug，应用oligo（dT）及SuperScriptⅡRNaseH-逆转录酶（Gibco BRL，Rockville，MD，USA）37℃1.5小时逆转录为cDNA。每个标本取1ul eDNA混匀后取1ul进行PCR。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，之后应用SYBR GreenⅠ（Molecular Probes；Eugene，OR）染色，分子显像FX检测电泳条带应用NIH成像分析软件进行分析。GAPDH作为内参，相同的条件进行检测。6、Westernblot法检测VEGF/VEGFR和PDGFB/PDGFRβ蛋白表达水平蛋白提取和蛋白定量后，取等量样品进行聚丙烯凝胶电泳，经一抗和二抗孵育后显色。分子显像FX检测电泳条带应用NIH成像分析软件进行分析。7、统计学分析所有原始数据采用Excel分析软件进行处理分析，均表示为平均值±标准差的形式，组间对比采用t检验，P<0.05具有统计学意义。结果1、从生理学（哮喘组小鼠气道反应性明显增高），血清学（哮喘组小鼠血清IgE水平明显增高），免疫学（哮喘组小鼠肺泡灌洗液嗜酸细胞计数明显增加，哮喘组小鼠炎性因子IL-4，IL-5水平增高）、病理学（HE染色）以及临床表现方面证实了本试验中的小鼠模型符合支气管哮喘。2、FITC—右旋糖苷灌注的正常及哮喘鼠切片激光共聚焦显微镜观察图片显示：与正常比较，早期和延长期哮喘鼠气管壁血管密度明显增加，血管扩张，在延长期气管壁观察到除了血管密度增加外，毛细血管明显扭曲，扩张，渗漏。应用激光共聚焦显微镜图像分析系统计算气道壁血管区域面积百分比，气管壁血管密度在慢性延长期明显增加。3、哮喘小鼠气管内皮细胞及血管壁细胞（平滑肌细胞或周细胞）表型发生变化，结构的改变间接提示功能发生变化。内皮细胞数慢性哮喘时明显增加，特别在小血管，壁细胞数急性期变化较大，数量减少特别是大血管，而随着疾病的进展，到慢性期，平滑肌的数量基本回复正常，这说明支气管哮喘气道血管重塑过程中不仅存在小血管的重塑，而且存在大血管的重塑，并且这种重塑是可逆的。4、应用RT-PCR技术及琼脂糖凝胶电泳，检测到VEGF 5个亚型mRNA表达，少见的亚型VEGF₁₄₄气管组织中无表达，周围肺组织中检测到其表达，而VEGF₁₆₄在气管组织，慢性哮喘期明显增高，VEGF₁₈₈在周围肺组织中mRNA表达在慢性哮喘期明显增高。支气管及肺组织的VEGFR1表达各组间无明显差异。而VEGFR2在正常气管组织中未检测到，而在支气管哮喘气管组织明显表达。Westernblot蛋白检测结果与基因表达基本一致。5、PDGFB mRNA在正常气管未检测到，而在支气管哮喘小鼠肺组织检测到其表达。在慢性延长期哮喘小鼠气管组织PDGFB mRNA显示出清晰的条带。周围肺组织在正常小鼠表达PDGFB mRNA，在慢性延长期表达明显增加。PDGFRβmRNA的表达与PDGFB相似。Westernblot蛋白检测结果与基因表达基本一致。结论1、在成功建立支气管哮喘A/J小鼠模型的基础上，支气管哮喘小鼠模型气道壁血管再生和重塑表现为：毛细血管网增加，扩张，渗透性增加；血管内皮细胞及壁细胞表型及数量发生改变，这种变化与血管大小、疾病时间相关。2、VEGF及VEGFR在支气管哮喘小鼠模型气道血管再生和重建中起着重要的作用。VEGF不同的亚型在支气管哮喘模型小鼠不同部位表达及作用存在差异。这提示VEGF信号活性在哮喘中存在不平衡性。VEGFR2在支气管哮喘中对于介导和增强VEGF信号和VEGF活性起着重要的作用，并且可能是导致VEGF诱导的微血管重塑增加的重要介质。3、PDGFB和PDGFRβ基因与蛋白表达水平在支气管哮喘气管及肺组织均增加，特别在慢性延长期，PDGFB和PDGFRβ系统在支气管哮喘气道血管再生和重塑过程中起着重要的作用。