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近年来，制备活性多肽的新技术越来越多，多数采取酶解的方法将蛋白转化成可以直接被吸收的小分子活性多肽，但是忽视了人体自身强大的胃肠消化功能，不仅大幅度增加了制造成本，而且往往会出现因为再次消化而降低多肽活性的问题。针对上述问题，本文提出将蛋白质体外酶解与体内胃肠消化整体考虑的技术方案，将活性评价移到模拟胃肠消化之后。这样作为产品生产环节，蛋白质不需要酶解到直接被吸收的小分子肽状态，产品的分子量较大，而是经过体内胃肠消化之后达到希望的分子量大小，本文称其为“浅度酶解”；活性评价后移，能够降低过度酶解状况的发生。本文通过超声预处理来提高蛋白的酶解效率，通过近红外光谱在线原位监测浅度酶解过程主要指标的动态实时变化支持今后智能化系统的设计。为了确认浅度酶解获得的牛奶大分子ACE抑制多肽是否真正具有降血压效果以及其安全性如何，本文进行了动物验证实验。
主要研究结论如下：
（1）牛奶浅度酶解方法的构建：以酶解产物的ACE抑制率为评价指标，对常见的8种酶和浅酶解最适水解度进行了筛选试验。结果表明，牛奶蛋白在经过中性蛋白酶酶解之后，达到17%的水解度，在此水解度下其产物模拟胃肠消化后的ACE抑制活性最高，确定17%的水解度是牛奶浅度酶解的前提条件。以此为基础，通过单因素逐级优化获得最适的酶解条件为：蛋白浓度3.4%、酶解温度55℃、pH值7.0、加酶量7%，酶解产物经过模拟胃肠消化之后比未消化之前ACE抑制活性提高了15.22%、IC50值降低了48.56%、多肽含量提高了41.98%，产物中200~500Da易吸收的寡肽含量提高了54.29%。与水解度45%的深度酶解所得的小分子肽相比，经浅度酶解获得的大分子肽经模拟胃肠消化后多肽含量提高了52.96%、IC50值降低了61.23%、产物中200~500Da易吸收的寡肽含量提高了8.79%，小于200Da的氨基酸等物质含量降低了71.76%。结果表明，本文提出的牛奶浅度酶解思路是正确的，可以作为一种低成本制备高活性牛奶多肽的新方法。
（2）超声预处理对牛奶浅度酶解强化试验研究：采用新型多模式超声预处理技术，提高蛋白酶解反应速度，改善酶解产物的活性。在相同的功率密度下（30W/L），研究单频超声、同步双频超声和顺序双频超声对牛奶浅度酶解效果的影响，发现28kHz单频狭缝式超声是最佳超声工作模式。在该模式下，优得到最适的利用超声预处理牛奶的条件为：超声时间40min、超声功率密度20W/L、牛奶蛋白浓度34g/L、间歇比2?4、料液初始温度30℃，之后经过34.48min的浅度酶解，酶解产物经过模拟胃肠消化后的ACE抑制率比未经超声提高了55.17%。通过对牛奶蛋白分子结构的比较分析发现，超声处理导致α-螺旋、β-转角的含量降低，β-折叠和无规则卷曲含量增加，说明促使了更多的疏水性基团暴露出来，酶解液中疏水性氨基酸所占总氨基酸的比例提高，改变了巯基和二硫键含量，从而提高酶解产物ACE的抑制活性。
（3）牛奶蛋白浅度酶解过程的原位实时监测模型的构建：利用光纤探头式微型近红外光谱设备建立了一种牛奶蛋白浅度酶解过程蛋白分子结构的原位实时监测系统。通过近红外光谱技术结合化学计量学方法，采用PLS、iPLS和Si-PLS三种方法，进行了酶解过程关键参数定量分析模型的建立，结果表明，相比Si-PLS，利用PLS和iPLS所建模型，能更好地根据光谱信息对浅度酶解过程中牛奶蛋白水解度、酶解产物及其胃和胃肠模拟消化产物的ACE抑制率的动态实时变化进行预测，为今后开展酶解过程智能化控制系统的科学设计提供了技术支持。
（4）浅度酶解牛奶大分子ACE抑制多肽安全性与副作用动物试验：小鼠急性经口毒性试验结果表明，牛奶大分子ACE抑制多肽对小鼠的体重增长没有显著性变化，给小鼠灌胃后饲养一段时间发现小鼠生长状况良好，无中毒现象发生。也未见其死亡，试验中得到其最大耐受量大于15000mg/kg·BW，说明牛奶大分子ACE抑制多肽样品均属无毒级。血清相关生化指标结果显示，牛奶大分子ACE抑制多肽对肌酸激酶同工酶、谷胱甘肽-S转移酶和乳酸脱氢酶同工酶活性均无影响，而卡托普利显著提高肌酸激酶同工酶和谷胱甘肽-S转移酶活性，上述结果暗示牛奶大分子ACE抑制多肽对心脏和肝没有损伤作用，而长期服用卡托普利对心脏和肝具有损伤性副作用。
（5）浅度酶解牛奶大分子ACE抑制多肽降血压效果、机制与多肽吸收动物试验：对原发性高血压大鼠4周的灌胃试验表明，血压平均降幅达60mmHg，其降血压效果与卡托普利相类似。牛奶大分子ACE抑制多肽通过降低肺、肾、动脉的ACE酶活力，以及调控血清指标中的内皮素、NO、血管紧张素II和肾素等信号因子含量达到降血压的效果。与深度酶解获得的小分子肽相比，浅度酶解获得的大分子肽经过胃肠消化后易直接吸收的多肽含量提高11.26%，并且经过动物试验验证，其进入血液中的多肽含量增幅明显高于小分子肽，提高了78.40%。
主要研究结论如下：
（1）牛奶浅度酶解方法的构建：以酶解产物的ACE抑制率为评价指标，对常见的8种酶和浅酶解最适水解度进行了筛选试验。结果表明，牛奶蛋白在经过中性蛋白酶酶解之后，达到17%的水解度，在此水解度下其产物模拟胃肠消化后的ACE抑制活性最高，确定17%的水解度是牛奶浅度酶解的前提条件。以此为基础，通过单因素逐级优化获得最适的酶解条件为：蛋白浓度3.4%、酶解温度55℃、pH值7.0、加酶量7%，酶解产物经过模拟胃肠消化之后比未消化之前ACE抑制活性提高了15.22%、IC50值降低了48.56%、多肽含量提高了41.98%，产物中200~500Da易吸收的寡肽含量提高了54.29%。与水解度45%的深度酶解所得的小分子肽相比，经浅度酶解获得的大分子肽经模拟胃肠消化后多肽含量提高了52.96%、IC50值降低了61.23%、产物中200~500Da易吸收的寡肽含量提高了8.79%，小于200Da的氨基酸等物质含量降低了71.76%。结果表明，本文提出的牛奶浅度酶解思路是正确的，可以作为一种低成本制备高活性牛奶多肽的新方法。
（2）超声预处理对牛奶浅度酶解强化试验研究：采用新型多模式超声预处理技术，提高蛋白酶解反应速度，改善酶解产物的活性。在相同的功率密度下（30W/L），研究单频超声、同步双频超声和顺序双频超声对牛奶浅度酶解效果的影响，发现28kHz单频狭缝式超声是最佳超声工作模式。在该模式下，优得到最适的利用超声预处理牛奶的条件为：超声时间40min、超声功率密度20W/L、牛奶蛋白浓度34g/L、间歇比2?4、料液初始温度30℃，之后经过34.48min的浅度酶解，酶解产物经过模拟胃肠消化后的ACE抑制率比未经超声提高了55.17%。通过对牛奶蛋白分子结构的比较分析发现，超声处理导致α-螺旋、β-转角的含量降低，β-折叠和无规则卷曲含量增加，说明促使了更多的疏水性基团暴露出来，酶解液中疏水性氨基酸所占总氨基酸的比例提高，改变了巯基和二硫键含量，从而提高酶解产物ACE的抑制活性。
（3）牛奶蛋白浅度酶解过程的原位实时监测模型的构建：利用光纤探头式微型近红外光谱设备建立了一种牛奶蛋白浅度酶解过程蛋白分子结构的原位实时监测系统。通过近红外光谱技术结合化学计量学方法，采用PLS、iPLS和Si-PLS三种方法，进行了酶解过程关键参数定量分析模型的建立，结果表明，相比Si-PLS，利用PLS和iPLS所建模型，能更好地根据光谱信息对浅度酶解过程中牛奶蛋白水解度、酶解产物及其胃和胃肠模拟消化产物的ACE抑制率的动态实时变化进行预测，为今后开展酶解过程智能化控制系统的科学设计提供了技术支持。
（4）浅度酶解牛奶大分子ACE抑制多肽安全性与副作用动物试验：小鼠急性经口毒性试验结果表明，牛奶大分子ACE抑制多肽对小鼠的体重增长没有显著性变化，给小鼠灌胃后饲养一段时间发现小鼠生长状况良好，无中毒现象发生。也未见其死亡，试验中得到其最大耐受量大于15000mg/kg·BW，说明牛奶大分子ACE抑制多肽样品均属无毒级。血清相关生化指标结果显示，牛奶大分子ACE抑制多肽对肌酸激酶同工酶、谷胱甘肽-S转移酶和乳酸脱氢酶同工酶活性均无影响，而卡托普利显著提高肌酸激酶同工酶和谷胱甘肽-S转移酶活性，上述结果暗示牛奶大分子ACE抑制多肽对心脏和肝没有损伤作用，而长期服用卡托普利对心脏和肝具有损伤性副作用。
（5）浅度酶解牛奶大分子ACE抑制多肽降血压效果、机制与多肽吸收动物试验：对原发性高血压大鼠4周的灌胃试验表明，血压平均降幅达60mmHg，其降血压效果与卡托普利相类似。牛奶大分子ACE抑制多肽通过降低肺、肾、动脉的ACE酶活力，以及调控血清指标中的内皮素、NO、血管紧张素II和肾素等信号因子含量达到降血压的效果。与深度酶解获得的小分子肽相比，浅度酶解获得的大分子肽经过胃肠消化后易直接吸收的多肽含量提高11.26%，并且经过动物试验验证，其进入血液中的多肽含量增幅明显高于小分子肽，提高了78.40%。