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背景恶性肿瘤是人类健康的重要威胁,并且其发病率和死亡率逐年上升。在临床治疗中,肿瘤治疗手段包括手术、放射治疗、化学药物治疗以及联合治疗等方式,但是效果并不理想,肿瘤患者的预后并没有明显改善。近年来,免疫治疗的发展为肿瘤患者提供了新的治疗方式。作为一种新型的肿瘤免疫治疗方式,嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）在B细胞恶性肿瘤中取得了较好效果,特别是以CD19为靶点的CAR-T细胞在B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中的完全缓解率高达90%。三种CAR-T细胞疗法Kymriah、Tecartus和Yescarta已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准,目前分别用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病和弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。尽管在治疗恶性血液病方面取得了进展,但是CAR-T细胞在实体肿瘤中的应用还有诸多限制,这主要取决于实体肿瘤中复杂的微环境以及缺乏良好的靶抗原。高复发率作为肿瘤治疗面临的主要难题,是限制CAR-T细胞治疗的主要因素,这一问题促使研究人员寻找更有效的CAR-T细胞。已有研究显示肿瘤干细胞在肿瘤复发中发挥着重要作用,肿瘤干细胞具有广泛的增殖潜能,可再生肿瘤并形成播散性和转移性肿瘤,是肿瘤进展和复发的关键原因。随着近年来免疫治疗的研究进展,CAR-T细胞的结构和制造方面的创新已导致功效和持久性的显着提高,尤其是随着第四代CAR-T细胞的发展,为T细胞的功能优化提供了更多的思路,如白介素15（IL-15）,白介素2（IL-2）以及白介素23（IL-23）等细胞因子及趋化因子与CAR-T细胞的联合有效提高了CAR-T细胞在肿瘤微环境中的抗肿瘤能力;双靶点CAR-T细胞的使用有效提高了靶向杀伤肿瘤细胞的特异性。但是,针对肿瘤干细胞的CAR-T细胞治疗目前还没有报道。本研究主要针对肿瘤干细胞导致的肿瘤复发问题对CAR结构进行改造,利用细胞因子白介素24（IL-24）能够有效诱导肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞干性的作用提高CAR-T细胞对肿瘤干细胞的抑制能力。本研究利用细胞模型、动物模型和临床标本等研究了 IL-24对CAR-T细胞功能的提高以及针对肿瘤干细胞的抑制作用。1 CAR-T细胞的杀伤诱导肿瘤干细胞的富集目的构建以NKG2DLs和HER2为靶点的CAR-T细胞,验证CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果,并分析肿瘤细胞的干性变化。方法（1）免疫组化检测靶抗原NKG2DLs及HER2在肿瘤组织的特异性表达;流式细胞术检测靶抗原NKG2DLs及HER2在肿瘤细胞系的表达情况;（2）用慢病毒转染的方法分别构建以NKG2DLs及HER2为靶点的CAR-T细胞;（3）使用流式细胞术及酶联免疫吸附实验检测CAR-T细胞对抗原阳性靶细胞的杀伤效果;（4）用流式细胞术及细胞成球培养等方法检测与CAR-T细胞共孵育后存活肿瘤细胞的干性富集。结果（1）通过对比NKG2DLs及HER2在肿瘤组织及癌旁组织中的表达,发现NKG2DLs在肺癌肿瘤组织中高表达,HER2在食管癌肿瘤组织中高表达;（2）流式细胞术结果显示,肺癌细胞系H460和Calu-3高表达NKG2DLs,而H322低表达NKG2DLs;食管癌细胞系KYSE150高表达HER2,而TE-7低表达HER2;（3）流式细胞术结果显示,CAR-T细胞能够有效杀伤靶点特异性肿瘤细胞,同时,酶联免疫吸附实验结果显示CAR-T细胞以抗原依赖的形式分泌大量效应细胞因子IL-2和IFN-γ;（4）流式细胞术及成球实验等结果显示,与CAR-T细胞共孵育后仍有部分肿瘤细胞存活且存活肿瘤细胞的干性明显增强。结论CAR-T细胞能够有效杀伤表达靶抗原的肿瘤细胞,但是会导致存活肿瘤干细胞的富集。2 IL-24抑制肿瘤细胞干性并促进肿瘤细胞凋亡目的检测IL-24对肿瘤细胞干性及存活能力的影响。方法（1）RT-PCR实验检测IL-24在肿瘤组织中的表达并分析IL-24与患者预后的相关性;（2）RT-PCR实验检测IL-24在肿瘤组织中的表达与肿瘤干性基因的相关性;（3）细胞荧光及流式细胞术检测IL-24对肿瘤细胞凋亡的影响;（4）RT-PCR,流式细胞术,细胞免疫荧光,免疫印迹及成球实验检测IL-24对肿瘤细胞干性的影响。结果（1）临床标本分析显示IL-24在肿瘤组织中低表达并且与病人预后正相关;（2）临床标本分析显示IL-24在肿瘤组织中的表达与多个肿瘤干性基因的表达负相关;（3）IL-24能够诱导肿瘤细胞凋亡;（4）IL-24能够抑制肿瘤细胞干性。结论IL-24在肿瘤组织中低表达并与病人预后正相关,IL-24能够诱导肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞干性。3 IL-24促进T细胞活化及增殖目的检测IL-24对T细胞活化,增殖,分化以及凋亡的影响。方法（1）RT-PCR实验检测IL-24在肿瘤组织中的表达与T细胞相关基因的相关性;（2）TCGA数据分析IL-24在肿瘤组织中的表达与T细胞相关基因的相关性;（3）RT-PCR实验检测IL-24处理对T细胞相关基因表达的影响;（4）流式细胞术实验检测IL-24处理对T细胞活化,增殖,分化以及凋亡的影响。结果（1）临床标本及TCGA数据分析显示IL-24在肿瘤组织中的表达与T细胞浸润,活化和功能基因表达正相关;（2）IL-24处理促进T细胞活化增殖并促进T细胞向中心记忆亚型分化;（3）IL-24处理不影响T细胞凋亡。结论IL-24在肿瘤组织中的表达与T细胞的浸润,活化及功能基因的表达正相关,IL-24处理促进T细胞活化增殖并促进T细胞向中心记忆亚型分化,但不影响T细胞凋亡。4 IL-24分泌型CAR-T细胞具有更强的肿瘤控制能力目的构建IL-24分泌型CAR-T细胞并验证其抗肿瘤活性。方法（1）共孵育实验用于检测IL-24分泌型CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性以及对肿瘤细胞干性的抑制;（2）肿瘤肺转移模型以及皮下荷瘤模型被用于检测IL-24分泌型CAR-T细胞对小鼠肿瘤进展的控制;（3）荷瘤小鼠晚期治疗模型被用于检测IL-24分泌型CAR-T细胞对晚期肿瘤进展的控制;（4）荷瘤小鼠复发模型被用于检测IL-24分泌型CAR-T细胞对肿瘤复发的控制。结果（1）IL-24分泌型CAR-T细胞拥有更强的抗肿瘤活性并能抑制肿瘤细胞干性;（2）IL-24分泌型CAR-T细胞能够更好的控制小鼠肿瘤进展;（3）IL-24分泌型CAR-T细胞能够更好的控制小鼠晚期肿瘤进展;（4）IL-24分泌型CAR-T细胞能够更好的控制小鼠肿瘤复发。结论IL-24分泌型CAR-T细胞拥有更强的抗肿瘤活性并能抑制肿瘤细胞干性,能够更好地控制小鼠肿瘤进展和复发。