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目的:流行病学研究表明,环境烟草烟雾暴露显著增加新生儿细菌性脑膜炎(Neonatal bacterial meningitis,NBM)的患病风险。尼古丁(nicotine,NT)是烟草烟雾的主要成分之一,对神经、血管和免疫系统等有多种危害,能促进脑膜炎大肠杆菌K1菌株(Escherichia coli K1)侵袭人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cell,HBMEC)。自噬作为真核细胞天然免疫的一个重要组成部分与病原体之间存在广泛的相互作用。一方面,某些病原体入侵可诱导宿主细胞自噬,并使病原体在自噬溶酶体中被降解;另一方面,长期进化使病原体形成了一套独特机制来逃避甚至利用宿主细胞自噬促进其生存。然而HBMEC自噬是否作为对抗E.coli K1的一种重要防御机制,以及NT是否会通过调控E.coli K1感染的HBMEC自噬促进胞内细菌的存活,目前尚不清楚。因此,本研究以体外经典的血脑屏障细胞模型--HBMEC为研究对象,探究NT暴露对E.coli K1感染的HBMEC自噬水平和入侵胞内的细菌存活的影响及其分子机制,以期为新生儿细菌性脑膜炎的发病机制提供新的研究资料。方法:(1)检测E.coli K1感染的HBMEC自噬水平:E.coli K1感染HBMEC不同时间点,Western blot检测自噬标志性蛋白LC3II的表达。(2)检测NT对E.coli K1感染的HBMEC自噬水平的影响:有无NT和α7nAChR拮抗剂α-银环蛇神经毒素(α-bungarotoxin,α-BTX)时,利用Western blot检测E.coli K1感染的HBMEC中自噬标志性蛋白LC3II和P62的表达;利用激光扫描共聚焦显微镜观察转染了mCherry-GFP-LC3质粒的HBMEC中自噬流的变化。(3)透射电镜观察E.coli K1感染的HBMEC中双层膜包裹E.coli K1的自噬小体的形态。(4)检测NT对E.coli K1感染的HBMEC中NF-κB的激活影响:有无NT和α-BTX时,利用Western blot检测E.coli K1感染的HBMEC中NF-κB激活标志p65蛋白亚基Ser-536位点的磷酸化(P-P65)水平。(5)抑制NF-κB的激活后E.coli K1感染的HBMEC自噬水平检测:利用BAY11-7082抑制NF-κB的激活,Western blot检测E.coli K1感染的HBMEC中P-P65、LC3II和P62的蛋白表达;利用激光扫描共聚焦显微镜观察转染了mCherry-GFP-LC3质粒的HBMEC中自噬流的变化。(6)检测NT对E.coli K1感染的HBMEC中自噬相关信号通路PI3K/AKT/mTOR的激活影响:有无NT和α-BTX时,利用Western blot检测E.coli K1感染的HBMEC中P-PI3K,P-AKT和mRORC1激活的下游蛋白P-P70S6K的表达水平。(7)检测自噬激活或抑制对HBMEC中E.coli K1存活率的影响:有无NT、α-BTX、NF-κB抑制剂BAY11-7082、自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂雷帕霉素时,通过稀释涂布平板计数,检测E.coli K1感染的HBMEC中胞内菌的存活率。(8)检测NT对E.coli K1感染的HBMEC中ICAM-1表达影响:有无NT时,利用Western blot检测E.coli K1感染的HBMEC中ICAM-1蛋白表达水平。(9)检测自噬激活或抑制对尼古丁暴露条件下E.coli K1感染的HBMEC中ICAM-1表达影响:有无3-MA和雷帕霉素时,利用Western blot检测E.coli K1感染的HBMEC中ICAM-1蛋白表达水平。结果:(1)E.coli K1感染的HBMEC中自噬标志蛋白LC3II的表达呈时间依赖性,且在感染后2h时LC3II蛋白升高最显著。(2)NT处理后,E.coli K1感染2h的HBMEC中LC3II蛋白表达显著降低,P62蛋白表达显著升高;α-BTX阻断NT与α7 nAChR相互作用后,LC3II蛋白表达显著升高,P62蛋白表达显著降低;NT显著阻断E.coli K1感染2h的HBMEC中自噬流。(3)感染HBMEC 2h时E.coli K1存在于双层膜包裹的自噬小体中。(4)NT处理后,E.coli K1感染2h的HBMEC中P-P65蛋白表达显著升高;α-BTX阻断NT与α7 nAChR相互作用后,P-P65蛋白表达显著下降。(5)NF-κB抑制剂BAY11-7082处理后,E.coli K1感染2h的HBMEC中P-P65蛋白表达显著降低,自噬相关蛋白LC3II表达显著升高,P62蛋白表达显著降低;抑制NF-κB激活,HBMEC中自噬流显著增加。(6)NT处理后,E.coli K1感染2h的HBMEC中P-PI3K、P-AKT和mRORC1激活的下游蛋白P-P70S6K的表达显著升高;α-BTX阻断NT与α7 nAChR相互作用后,P-PI3K,P-AKT和P-P70S6K的蛋白表达显著下降。(7)NT处理的HBMEC中E.coli K1存活率显著升高,α-BTX阻断NT与α7 nAChR相互作用后,胞内E.coli K1存活率显著下降;BAY11-7082抑制NF-κB的激活E.coli K1存活率显著下降;雷帕霉素诱导自噬后,胞内E.coli K1存活率显著下降。(8)NT处理后,E.coli K1感染2h的HBMEC中ICAM-1蛋白表达显著升高。(9)激活自噬ICAM-1蛋白表达显著降低。结论:尼古丁暴露通过促进E.coli K1感染的HBMEC中自噬相关信号通路PI3K/AKT/mTOR和NF-κB信号通路激活,抑制自噬,促进胞内E.coli K1的存活和ICAM-1蛋白的表达。