研究背景:在中国,原发性肝癌是癌症相关死亡的第二大原因,在发病率方面排名第四,肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的病理类型,也是最常见的肝脏恶性肿瘤,其病因复杂,起病隐匿,进展迅速,恶性程度高,首诊时多为中晚期,失去根治性手术切除的机会,因此预后较差。系统药物治疗是目前中晚期肝细胞癌的主要治疗手段,索拉非尼（Sorafenib,SF）作为常见的标准一线靶向治疗药物,可以明显延长中晚期HCC的总生存期。然而,索拉非尼在临床应用中实际有效率只有大约30%,而且随着药物的应用会出现获得性耐药。因此,对索拉非尼敏感性差一直是制约晚期肝细胞癌靶向治疗效果的一个重要因素。因此,研究索拉非尼抗癌的分子机制以及探索发现新的治疗靶点,对研发抗肿瘤药物、提高索拉非尼治疗肝细胞癌的效能尤为重要。作为一种新的程序性细胞死亡类型,铁死亡在形态学、生物化学和遗传学上完全不同于凋亡、坏死和自噬。2012年,由Stockwell等人首次命名,其特征是细胞内铁离子依赖地脂质过氧化物和脂质活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的聚集,引起细胞内氧化还原环境的失衡,导致细胞死亡。目前,索拉非尼已被确定为铁死亡的诱导剂,通过阻断System Xc-介导的半胱氨酸输入并减少谷胱甘肽的生物合成,导致细胞内谷胱甘肽（GSH）的耗竭,诱导脂质过氧化的积累导致细胞死亡。目前的研究显示,索拉非尼诱导肝细胞癌的铁死亡与其抑制多激酶活性无关,而是通过抑制上述提及的System Xc-从而诱导铁死亡,且相较于依赖其激酶抑制活性的促凋亡效应,索拉非尼更能促使肿瘤细胞发生铁死亡。可见铁死亡在索拉非尼治疗肝细胞癌中扮演重要角色。因此,越来越多的研究人员开始关注于发现参与调控铁死亡的调控蛋白、小分子化合物、以及通路等,以提高癌症药物治疗的效果。N6-腺苷酸甲基化（m6A）是真核生物中在转录后水平上发生的最常见的RNA内部修饰。m6A修饰影响到RNA代谢的多个方面,从RNA加工、核出口、RNA翻译到衰变,从而以转录后的方式控制蛋白质的表达。最新的一些研究表明,m6A可以参与微调包括细胞凋亡、自噬和铁死亡在内的细胞程序性死亡途径,进而调节癌症的发生和发展。m6A由m6A甲基转移酶（Writer）组装,由阅读蛋白（Reader）识别,并由m6A去甲基化酶（Eraser）擦除。已有研究证实,IGF2BP3作为已知的m6A的阅读蛋白（Reader）能够识别并结合到其目标mRNA的m6A修饰位点,从而调控目标RNA的表达水平,进而影响蛋白的表达水平。IGF2BP3是胰岛素样生长因子-Ⅱ mRNA结合蛋白（IGF2BPs,包括IGF2BP1/2/3）家族的重要成员,IGF2BP3的上调与包括HCC在内的各种人类癌症的肿瘤侵袭、早期复发和不良预后密切相关。体外研究也表明,IGF2BP3是通过转录后调控肿瘤生长、耐药和转移的。然而,到目前为止,IGF2BP3在HCC细胞铁死亡中的作用及分子机制并不清楚。在本研究中,首先通过对公共基因表达数据的挖掘,进一步探讨了 IGF2BP3的基因在HCC中的表达情况以及其与HCC预后的相关性。发现IGF2BP3在HCC肿瘤及门静脉癌栓中高表达,且高表达与早期复发及不良预后相关。然后通过检测HCC细胞进行索拉非尼处理后的活性氧（ROS）、Fe2+、丙二醛（MDA）和铁死亡相关标志蛋白的水平,我们发现敲低IGF2BP3明显增强了 HCC细胞对索拉非尼诱导的铁死亡敏感性。此外,通过生物信息学分析、RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）和RNA沉降（RNAPulldown）实验,NRF2mRNA被确定为IGF2BP3的一个重要靶点。更重要的是,IGF2BP3作为一个m6A的“Reader”,被证明能通过识别NRF2mRNA的m6A修饰来调控NRF2mRNA稳定性,在体内实验中也得到了类似的结果。综上所述,我们的研究揭示了 IGF2BP3-NRF2通路在索拉非尼诱导的HCC铁死亡中的调控作用,为新抗癌策略和药物研发提供了重要的理论依据。第一部分IGF2BP3对索拉非尼诱导肝细胞癌铁死亡的影响的研究研究目的:探讨IGF2BP3对索拉非尼诱导的HCC铁死亡的影响。研究方法:1.通过对公共基因表达数据的挖掘,进一步探讨了 IGF2BP3的基因在HCC中的表达情况以及其与HCC预后的相关性。2.利用瞬时转染方法构建敲低IGF2BP3的Huh7细胞系及Hep3B细胞系。3.应用活性氧检测试剂盒（DCFH-DA荧光探针法）进行活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）含量的检测,使用共聚焦显微镜观察敲低IGF2BP3后索拉非尼对HCC细胞内ROS含量的影响。4.在Fer-1/Z-VAD-FMK存在或不存在的情况下,应用C11 BODIPY 581/591（用于检测脂质氢过氧化物的荧光探针）染色结合流式细胞仪的进行定量分析,观察敲低IGF2BP3后索拉非尼对HCC细胞内脂质氢过氧化物含量的影响。5.应用细胞活力检测试剂盒（CCK-8）检测HCC细胞的生长抑制,观察索拉非尼敲除IGF2BP3后对HCC细胞生长抑制的影响,并通过不同的细胞死亡抑制剂（铁死亡抑制剂:Fer-1;细胞凋亡抑制剂:Z-VAD-FMK）鉴定影响索拉非尼诱导的HCC细胞的生长抑制类型。6.应用丙二醛（MDA）检测试剂盒进行丙二醛（MDA）（一种脂质过氧化的终产物）含量的检测,观察敲低IGF2BP3后索拉非尼对HCC细胞内丙二醛（MDA）含量的影响。7.应用铁检测试剂盒进行铁含量的检测,观察敲低IGF2BP3后索拉非尼对HCC细胞内铁含量的影响。8.应用Western Blot检测敲低IGF2BP3对铁死亡关键调节蛋白SLC7A11和GPX4表达的影响,以探究敲低IGF2BP3对索拉非尼诱导的铁死亡的影响。9.分别皮下注射敲低IGF2BP3及阴性对照的Huh7细胞系,进行裸鼠成瘤实验。对裸鼠按10mg/kg的用药量腹腔注射索拉非尼,每2天1次,持续给药6周。每周需要对肿瘤体积进行测定,最后对收集的肿瘤进行重量的测定,观察敲低IGF2BP3对裸鼠成瘤的影响。10.提取裸鼠肿瘤组织的蛋白,应用Western Blot实验进行SLC7A11、GPX4的表达进行检测,观察敲低IGF2BP3对铁死亡的影响。研究结果:1.IGF2BP3在人类HCC肿瘤及门静脉癌栓中表达显著上调,IGF2BP3基因表达水平越高,无病生存期与总生存期越短,提示IGF2BP3可能与HCC的侵袭、早期复发及不良预后相关。2.用DCFH-DA荧光探针结合共聚焦显微镜观察索拉非尼对敲低IGF2BP3的HCC细胞内ROS的影响,结果显示在两种HCC细胞系经索拉非尼处理后敲低IGF2BP3的HCC细胞较阴性对照组荧光强度明显增强,提示ROS含量明显升高。3.C11 BODIPY 581/591荧光探针结合流式细胞仪定量分析索拉非尼对敲低IGF2BP3的Huh7细胞内脂质氢过氧化物含量的影响,结果显示Huh7细胞经索拉非尼处理后敲低IGF2BP3的细胞内脂质氢过氧化物含量较阴性对照组显著升高,而且Fer-1能明显抑制脂质氢过氧化物的这种升高,而Z-VAD-FMK不能。4.CCK-8实验结果显示Huh7细胞进行索拉非尼处理后,敲低IGF2BP3的细胞较阴性对照组细胞生长抑制作用明显增强,而且这种增加的生长抑制的作用能被Fer-1大部分拮抗,而Z-VAD-FMK的拮抗作用不明显。5.MDA（一种重要脂质过氧化的终产物）检测结果显示,索拉非尼处理后,IGF2BP3敲低的HCC细胞和阴性对照的HCC细胞的MDA含量都有所增加,而索拉非尼处理后,IGF2BP3敲低的HCC细胞的MDA含量增加更为明显。6.铁含量检测实验结果显示两种HCC细胞系经索拉非尼处理后,敲低IGF2BP3的HCC细胞内铁含量出现显著升高;而未经索拉非尼处理的HCC细胞里,敲低IGF2BP3的HCC细胞内铁含量升高不明显。7.Western Blot实验结果显示Huh7和Hep3B细胞系经索拉非尼处理后敲低IGF2BP3的细胞和阴性对照组细胞内GPX4、SLC7A11的含量均出现下降;敲低IGF2BP3的细胞经索拉非尼处理后GPX4、SLC7A11的含量下降更为显著。8.对裸鼠肿瘤的重量及体积进行测定,结果显示敲低IGF2BP3的HCC肿瘤的重量和体积均显著低于阴性对照组。然后对肿瘤组织进行Western Blot实验结果显示与阴性对照组相比敲低IGF2BP3的HCC肿瘤组织中GPX4和SLC7A11的表达水平明显降低。结论:1.IGF2BP3在HCC肿瘤及门静脉癌栓中高表达,IGF2BP3基因表达水平越高,HCC的侵袭性越强、越容易早期复发、预后越差。2.索拉非尼能激活HCC的铁死亡。3.敲低IGF2BP3可以明显促进索拉非尼诱导的HCC细胞铁死亡。4.敲低IGF2BP3可以通过促进索拉非尼诱导的HCC细胞铁死亡提升索拉非尼在裸鼠体内的抗肿瘤的效能。第二部分 IGF2BP3调控肝细胞癌铁死亡的分子机制的研究研究目的:探索IGF2BP3下游的调节因子及其调控HCC铁死亡的机制。研究方法:1.应用生物信息学方法,通过PubMed,、KEGG、RBPmap和RBPDB等数据库初步预测与IGF2BP3潜在结合并参与铁死亡途径的mRNAs。2.在Huh7细胞里应用RBP-RIP实验从上述预测结果中进一步筛选结合水平最高的mRNA。然后通过RNA pull-down实验进一步验证。3.在Huh7和Hep3B细胞里通过MeRIP（甲基化RNA免疫沉淀）实验,使用抗m6A抗体免疫沉淀甲基化的目标mRNA（前两步实验已验证的）,并通过qPCR评估HCC细胞系内该目标mRNA的m6A的丰度。同时通过qPCR评估敲低IGF2BP3后对HCC细胞内目标mRNA的表达水平的影响。4.应用放线菌素D（Act D）处理Huh7和Hep3B细胞后,通过qPCR检测不同时间点敲低IGF2BP3对目标mRNA表达水平的影响。5.应用生物信息学方法,利用网站工具RBPmap和SRAMP网站工具初步预测IGF2BP3与目标mRNA潜在的m6A结合位点。预测的目标mRNA的m6A潜在位点进行碱基突变,并通过双荧光素酶报告基因检测实验进行验证,确定IGF2BP3与目标mRNA具体的m6A结合位点。6.Rescue实验:应用Western Blot实验检测Huh7和Hep3B细胞系里敲低IGF2BP3以及敲低IGF2BP3后过表达目标蛋白后,目标蛋白、铁死亡关键调节蛋白SLC7A11和GPX4表达水平的变化,以明确IGF2BP3是否通过影响该下游的目标蛋白来影响铁死亡水平。7.提取裸鼠肿瘤组织的蛋白,应用Western Blot进行目标蛋白、SLC7A11、GPX4的表达进行检测,观察敲低IGF2BP3对目标蛋白以及铁死亡的影响。研究结果:1.通过PubMed、KEGG、RBPmap和RBPDB等数据库的交叉分析,初步预测筛选出了结合能力排前四的四个转录本（ACSL4、NRF2、TFRC和PRNP）。2.应用RNA免疫共沉淀（RBP-RIP）实验发现anti-IGF2BP3-mRNA复合物中的NRF2 mRNA含量最高,提示IGF2BP3最容易与NRF2 mRNA结合,IGF2BP3可能为NRF2的调控蛋白。3.在RNA pull-down实验中,NRF2 mRNA探针明显富集IGF2BP3蛋白,表明IGF2BP3和NRF2 mRNA的结合,提示IGF2BP3可能参与调节NRF2。4.MeRIP（甲基化RNA免疫沉淀）并通过qPCR评估,结果显示,NRF2 mRNA在Huh7和Hep3B细胞系中都有丰富的m6A修饰。qPCR结果还显示,敲低IGF2BP3会显著降低NRF2mRNA的表达水平。5.用ActD（放线菌素D,1μg/ml）阻断NC或敲低IGF2BP3的细胞中新RNA的合成,并在不同时间点评估mRNA的衰减。发现敲低IGF2BP3的HCC细胞中的NRF2 mRNA水平与阴性对照组相比,都明显下降。这些表明IGF2BP3可能是通过影响NRF2 mRNA的稳定性影响其表达水平的。6.应用生物信息学方法,通过RBPmap和SRAMP数据库工具预测出了 IGF2BP3与NRF2 mRNA两个m6A结合位点。该结合位点位于CDS（编码序列）区域的+1482（从起始密码子开始）或+1486碱基处。通过双荧光素酶报告基因检测实验验证出NRF2 mRNA的+1482碱基最有可能是IGF2BP3的结合部位。7.Western blot检测证实,在HCC细胞里过表达NRF2可以明显恢复因IGF2BP3敲低引起的GPX4和SLC7A11（铁死亡的标志物）的水平降低。8.Western Blot实验结果显示与阴性对照组相比敲低IGF2BP3实验组裸鼠肿瘤组织中NRF2、GPX4和SLC7A11的表达水平明显降低。结论:1.IGF2BP3 能与NRF2 mRNA 结合。2.IGF2BP3可能通过影响NRF2 mRNA的稳定性来调控NRF2表达。3.IGF2BP3可能通过与NRF2 mRNA的m6A修饰位点结合来调控NRF2 mRNA的稳定性。4.IGF2BP3可能通过调控NRF2的表达影响HCC的铁死亡。