猝死是法医司法鉴定中最常见也是最复杂的问题之一。一般地,成人猝死多是心源性猝死。心源性猝死一般是由于多种心脏疾病导致的急速发生的、出人意料的自然死亡。临床上导致心源性猝死的原因较多,如冠状动脉狭窄导致心脏急性的缺血、缺氧;应激情况下儿茶酚氨的释放增加致使心室电生理紊乱,引起暂时严重心律失常如室颤,导致心源性猝死。另外,心肌的炎症、纤维化以及心室结构的改变,均可以成为心源性猝死的基础。目前临床中心源性猝死的患者多有心脏病史,最常见的就是冠心病引起的急性心肌缺血缺氧。早期心肌缺血缺氧所致猝死心肌的变化,在法医病理鉴定中十分困难,有待探寻标记物在分子水平上进行鉴别诊断。近来的研究表明,心脏中存在着心肌干细胞,缺氧诱导因子在调节心肌干细胞增殖过程中发挥着重要作用,可使心肌再生,使受损的心肌修复,进而改善心脏的功能。micro RNA是长21-26个核苷酸的内源性单链非编码RNA,结构一般高度保守。micro RNA通过特异性的结合靶基因m RNA的3’-UTR相应基因序列,进而抑制靶基因的翻译过程或直接促进下游m RNA的降解,调控相关蛋白的表达,是基因表观调控细胞生物学功能的重要途径。现已证实miRNA的调控功能复杂而且广泛,涉及人体约60%的蛋白表达和近乎所有细胞的生物学功能,包括组织血管生成,新陈代谢,细胞生长分化、增殖、凋亡、癌变等所有生物过程。micro RNAs作为多个靶点的上游调控因子,调控受损心肌修复及心肌干细胞的增殖而受到越来越多的关注。有报道,正常细胞中存在miR-138,但miR-138与缺氧诱导因子在心肌组织中作用的关系尚不清楚。Sca-1认为是心肌干细胞标记物。本研究通过对选取人心肌梗死尸检案例和大鼠心肌细胞系H9C2,并选用miR-138、缺氧诱导因子1 alpha(Hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF),Notch1、Sca-1观察其在不同时期心肌梗死时间点的表达变化,通过重组腺病毒上调与下调miR-138的表达对HIF-α﹑Sca-1﹑Notch1、CTGF的转录和翻译水平的影响及对心肌梗死修复与心肌干细胞的增殖调控作用,探讨miR-138及HIF-1α在缺氧梗死心肌组织细胞中的作用机制,同时寻找早期因缺血缺氧致猝死的的法医病理鉴定的方法和标记物。第一部分miR-138与HIF-1α在人心肌梗死组织中的表达意义及相关性分析目的:探讨不同时期的心肌梗死组织中miR-138与HIF-1α及其相关分子表达特点和心肌干细胞的增殖情况及其意义。方法:1.提取人心肌组织中的micro RNA,利用RT-PCR检测各组心肌梗死组织中miR-138的表达情况,同时检测不同时段心肌梗死组织中HIF-α在基因水平的表达情况。2.采用免疫组织化学的方法,检测各组心肌细胞中HIF-α、CTGF、Notch1以及Sca-1的表达。3.运用SPSS13.0统计软件对miR-138、HIF-1α、CTGF、Notch1和Sca-1表达情况进行比较和分析,探讨其相关性。结果:1.miR-138在心肌组织中均有表达,miR-138在正常心肌组织中表达较低,在心肌梗死组中表达明显升高,在晚期心肌梗死组中的表达高于早期心肌梗死组。HIF-1αm RNA在早期心肌梗死组中表达高于正常心肌组与晚期心肌梗死组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.HIF-1α、Notch1以及Sca-1蛋白在正常心肌组织及晚期心肌梗死组中表达较低,呈弱阴性;HIF-1α、Notch1以及Sca-1在早期缺氧心肌梗死组中表达明显呈上升的趋势,高于正常心肌及晚期缺氧心肌梗死组,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。3.CTGF在晚期心肌梗死组中表达明显高于正常心肌与早期心肌梗死组,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-138与HIF-1α表达呈负相关,HIF-1α与Sca-1的表达呈正相关,提示miR-138可能抑制HIF-α的表达,通过抑制HIF-α/Notch1信号通路抑制干细胞的增殖。HIF-1α和Sca-1可作为早期缺氧致心肌梗死标记物的参考。晚期缺氧心肌梗死组织中CTGF的表达显著增多,提示miRNA-138与心肌修复的纤维化有关。第二部分构建携带大鼠miR-138基因及慢病毒载体,稳定转染大鼠心肌细胞H9C2的研究目的:分别构建miR-138真核质粒表达载体,通过鉴定,然后再构建miR-138慢病毒载体,最后再将载体转染至H9C2大鼠心肌细胞中,为研究缺氧引起的心肌梗死的生物学机制,提供有效的细胞模型及实验平台。方法:1.常规培养大鼠心肌细胞系H9C2细胞,基因检测miR-138的基因表达,应用荧光定量PCR技术扩增miR-138,然后将PCR扩增产物和预先设计好的载体p EGFP-N1连接,从而构建完整的p EGFP-miR-138载体,经过酶切、测序证实之后采用Lipofectamine 2000转染试剂盒将质粒瞬时转染至H9C2细胞中。2.构建Lenti-138-EX慢病毒表达载体,并包装、纯化慢病毒,经鉴定慢病毒包装成功后将其感染大鼠心肌细胞,提取总RNA,在基因水平检测miR-138在大鼠心肌细胞H9C2中的表达变化。结果:从H9C2细胞基因组中成功扩增出含有miR-138基因的目的片段,并将其连接到载体p EGFP-N1,命名为p EGFP-miR-138,且转染H9C2细胞效果较好。成功包装了能够表达绿色荧光蛋白的慢病毒载体,命名为Lenti-miR-138。结论:成功构建了miR-138真核质粒表达载体和慢病毒载体,并获得稳定转染的H9C2细胞,为深入研究miR-138在心肌缺氧及梗死调控机制提供了有效的工具和平台。第三部分miR-138与HIF-1α靶向关系的研究目的:验证HIF-1α是miR-138的下游靶向调节基因。方法:利用生物信息学软件Target Scan(www.target Scan.org)软件预测miR-138的下游调节基因。进一步采用双荧光素酶报告基因系统检测miR-138与靶基因HIF-1α3’-UTR序列的相互作用关系。结果:通过Target Scan系统检测,miR-138与靶基因HIF-1α3’-UTR序列存在靶向调节序列。进一步采用双荧光素酶报告基因系统检测发现,miR-138与靶基因HIF-1α3’-UTR序列具有相互作用,miR-138可以在转录与翻译水平上调节HIF-1α的表达。结论:miR-138可以靶向调节HIF-1α的表达,HIF-1α是miR-138的下游靶基因。第四部分miR-138通过调节HIF-1α表达在心肌缺氧梗死后心肌重构的分子机制研究目的:观察缺氧时大鼠心肌细胞H9C2 miR-138与HIF-1α表达变化与纤维蛋白、心肌干细胞标记物表达的关系。方法:采用体外心肌细胞培养的方法,通过转染miR-138 mimics或miR-138inhibitors或基因干扰,分别上调或下调H9C2细胞中miR-138的表达、上调H9C2细胞中HIF-1α表达。经氯化钴处理后,流式细胞仪检测不同组别细胞凋亡比例,以及通过实时定量PCR与Western blot方法,分别检测心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2、Sca-1、Notch1及CTGF的表达变化。结果:利用二氯化钴成功构建大鼠心肌缺氧模型;上调miR-138表达,可以促进缺氧条件下心肌细胞的凋亡,下调miR-138表达或者上调HIF-1α的表达,可以抑制心肌细胞在缺氧条件下的凋亡。上调HIF-1α的表达,可以促进心肌干细胞标记物Sca-1和Notch1的表达,抑制CTGF的表达。结论:miR-138可以调节HIF-1α的表达,HIF-1α在低氧环境条件下可以通过Notch1信号通路促进心肌干细胞的增殖,miR-138可能通过调控CTGF的表达,影响心肌梗死后心肌纤维化的进程。