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苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL,EC 4.3.1.5）催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸,是植物苯丙烷代谢途径的第一个酶,是连接初级代谢和次级代谢的关键酶和限速酶。目前有关PAL的研究主要集中在PAL鉴定、蛋白质结构、转录水平调控及生物学功能等方面,关于植物PAL的翻译后修饰及细胞内活性调控的研究报道较少。苦荞叶片和籽粒存在丰富的黄酮类物质。前期研究发现苦荞叶片中检测不到PAL活性但存在高水平的基因转录和高含量的下游次生代谢产物的积累,体外分析显示下游次生代谢产物对PAL活性仅表现微弱的抑制效应;26S蛋白酶体抑制剂MG132可以提高苦荞叶片中PAL的活性,且通过酵母双杂筛选发现FtPALB与泛素连接酶FtPUB26互作。以上信息显示苦荞叶片中可能存在PAL快速失活的翻译后修饰调控机制。探究苦荞PAL翻译后调控机制,对于丰富苦荞乃至植物PAL参与的次生代谢调控网络具有重要理论意义。本课题基于课题组前期研究,在分析苦荞PAL基因表达水平、蛋白水平、活性及黄酮含量变化的规律的基础上,构建苦荞PAL的体外泛素化体系,并分析泛素化修饰对PAL酶活性及动力学参数的影响,以期为探讨体内PAL翻译后调控网络奠定基础。（1）对10天苗龄的苦荞幼苗黑暗处理24h后进行光照,分析不同光照时长处理下苦荞子叶PAL与PUB26的转录水平、PAL蛋白水平、活性水平以及黄酮含量,探究PAL活性在光照处理下的变化规律。结果表明,在黑暗处理条件下,苦荞PAL和PUB26的转录水平、PAL蛋白水平、活性水平和黄酮含量均下降;FtPALB、FtPALN与FtPUB26转录水平在光照0-24h持续升高,PAL蛋白含量在3h升高并保持相当水平至9h,PAL活性在3h达到最高,黄酮含量在6h达到峰值。转录水平和活性、黄酮含量的差异表明苦荞PAL可能存在翻译后修饰的重要调控。（2）通过比对苦荞基因组数据,对苦荞FtPALB、FtPALN、FtPUB26启动子进行克隆,构建至p Cambia-3301载体。顺式作用元件分析表明,三个基因启动子上均具有大量的光响应元件、数个MYB响应元件、激素响应元件、低温、干旱响应元件、种子特异性表达元件,在FtPALB和FtPUB26启动子中还有损伤响应元件。大量相似的顺式作用元件暗示着FtPALB、FtPALN和FtPUB26可能具有相同的表达模式,为分析FtPUB26可能泛素化调控FtPALB和FtPALN提供了基础的指导信息。（3）以欧芹PAL为模板对FtPALB同源建模显示FtPALB以四聚体形式发挥功能。泛素化位点预测工具对其泛素化位点进行预测显示K136、K506、K633和K668为可能的被泛素化位点。其中,K136和K506处于亚基互作表面,K633和K668处于活性中心口袋附近。这些分析为后续通过突变等方式研究泛素化对PAL活性调控提供了基础信息。（4）酵母双杂交及Pull-down对FtPALB与FtPUB26进行互作验证,结果表明,FtPUB26和FtPALB在体外存在物理互作。（5）泛素化体系包括泛素活化酶E1、泛素转移酶E2和泛素连接酶E3、泛素（Ubiquintin,Ub）和底物。使用双表达框兼容性载体,在大肠杆菌体内构建表达5个蛋白的泛素化系统,将苦荞FtPALB与泛素活化酶At UBA1共同构建至双框表达载体p CDFDuet-1;苦荞FtPUB26与泛素转移酶At UBC8共同构建至双框表达载体p ACYCDuet-1;苦荞Ft Ub基因构建至p RSFDuet-1表达载体。将构建成功的三个载体共转化大肠杆菌BL21 Star（DE3）,并分析FtPAL的泛素化效应。结果显示,At UBA1、At UBC8、FtPUB26、Ft Ub、FtPALB均可在大肠杆菌BL21 Star（DE3）中高效表达。利用Ub抗体Western Blotting结果显示FtPUB26具有PUB型泛素连接酶典型的自泛素化活性。利用Ub及MBP抗体Western Blotting检测显示,从诱导表达的共转大肠杆菌菌体中纯化的FtPALB可被FtPUB26泛素化。该体外泛素化体系的建立为深入分析泛素化对FtPAL活性的调控奠定了基础,同时为分析活性调控的泛素化修饰位点、不同泛素化形式与酶活性的调控的关系提供了研究基础。（6）重组FtPALB和泛素化FtPALB的酶促反应动力学参数测定显示,泛素化修饰后,FtPALB的酶活力显著下降,约为天然FtPALB酶活力的70.4%;天然FtPALB的Km值为0.11mmol/L,Vmax值为257.5U/mg;泛素化FtPALB的表观Km值为0.35mmol/L,Vmax值为29.4U/mg。被泛素化修饰后,FtPALB对底物的亲和力下降,最大反应速度下降。以上研究基于“苦荞叶片中检测不到PAL活性但存在高水平的基因转录和高含量的产物的积累”这一现象,利用酵母双杂交等技术分析互作蛋白,成功构建了PAL的体外泛素化体系。实验表明泛素化修饰可负调节PAL的活性。研究结果为通过体内实验探究PAL的翻译后水平的调控奠定了基础。