论文部分内容阅读
盐碱化土壤的改良与利用是全世界所面临的难题。长期以来人们开展了许多盐生植物生理生态的科学研究，以对盐碱地进行生物改良。然而由于缺乏盐碱化土壤微生物分离、培养的方法研究，盐碱地改良前后土壤微生物的群落结构未受到足够的关注。而土壤微生物群落组成作为土壤生态系统的重要组成部分，不仅是评估土壤改良效果的重要指标，也是改良后土壤可持续利用、以及盐碱化环境下微生物资源的开发与利用的基础。因此，利用现代分子生物学手段，研究土壤微生物群落在盐碱地改良过程中的动态变化，不仅对认识盐碱地改良的微生物机制、全面评估改良效果、实现盐碱地的永续利用具有重要的指导意义，也将为后续生物改良剂的研发提供重要的生物资源。 本论文主要以宁夏银北地区施用脱硫废弃物改良剂的盐碱地土壤作为研究对象，将生化和分子生物学方法相结合，运用磷脂脂肪酸法(PLFA)、Real-timequantitativePCR、构建克隆文库、变形梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)等多种方法，分析脱硫废弃物施用量对土壤的微生物生物量和群落结构的影响。论文还对施用脱硫废弃物基础上再施用氮肥对土壤微生物群落和氨氧化微生物的影响进行研究，进一步探究脱硫废弃物在微生物生物量、群落结构和功能基因群落中的调控作用，为下一步改良剂开发提供线索。主要实验结果如下： 1.施用脱硫废弃物对土壤微生物群落的影响。脱硫废弃物施用量设5个处理(水平)：(1)不施脱硫废弃物(C)；(2)施脱硫废弃物0.74kgm-2(T1)；(3)施脱硫废弃物1.49kgm-2(T2)；(4)施脱硫废弃物2.25kgm-2(T3)：(5)施脱硫废弃物3.00kgm-2(T4)。采集2009年和2010年8月份0-20cm和20-40cm土样。结果显示：施用脱硫废弃物后土壤理化因子发生显著变化。0-20cm土层，Ca2+和NO3--N含量随着施用量增加而增加；土壤pH值、电导率值(EC)显著下降。PLFA、qPCR两种研究方法均表明，微生物群落结构随着脱硫废弃物的施用发生变化，但这种变化并不与脱硫废弃物的施用量呈线性关系。改良第一年(2009)，施脱硫废弃物2.25kgm-2之使得总PLFA、革兰氏阴性菌略高于其他处理。2010年，0-20cm土层，总PLFA、细菌(B)、革兰氏阳性菌(G+)、革兰氏阴性(G-)、真菌(F)、F/B均在T2和T4处理组高于其它处理。Real-timePCR结果显示：施脱硫废弃物使得细菌16SrRNA基因拷贝数处理组显著高于对照组。氨氧化古菌amoA(AOA)与氨氧化细菌amoA(AOB)基因拷贝数在T2和T4处理高于其它处理。20-40cm土层各处理间微生物群落没有显著变化，或没有出现规律的变化趋势。因此，本研究中施用脱硫废弃物1.49kgm-2(T2)是引起微生物生物量和功能基因丰度增加的阈值，并且脱硫废弃物对上层土壤的影响更显著。构建细菌克隆文库结果显示：研究样地土壤以放线菌门(Actinobacteria)为优势群落。施用脱硫废弃物后变形菌门(Proteobacteria)比对照增长11.8％，Actinobacteria下降2.4％，脱硫废弃物使细菌群落结构发生了变化。 2.施加脱硫废弃物和氮肥对土壤微生物群落和氨氧化微生物丰度的影响。根据脱硫废弃物和氮肥的不同用量共设八个处理：(1)C(不施氮肥，不施脱硫废弃物，原始荒地)；(2)不施氮肥(N0)；(3)施氮肥2.5gm-2(N2.5)；(4)施氮肥5gm-2(N5)；(5)施氮肥10gm-2(N10)；(6)施氮肥20gm-2(N20)；(7)施氮肥40gm-2(N40)；(8)施氮肥80gm-2(N80)，在N0-N80处理施用脱硫废弃物3.72kgm-2。2011年8月采集0-20cm土样。结果显示：脱硫废弃物和氮肥配合施加对土壤理化性质产生了显著影响。测定结果显示：NO3--N和NH4+-N含量在施氮处理中相对于原始样地和不施氮处理组都有显著的升高。微生物生物量和细菌和氨氧化细菌多样性指数在施氮40gm-2达到最大值。本实验中施氮肥40gm-2是促进微生物量和群落多样性增加的最佳施用量。Real-timePCR结果显示：AOB丰度在施氮肥40gm-2和80gm-2显著高于其它处理，脱硫废弃物和氮肥配合施用对AOB的丰度具有叠加效应。其中氨氧化细菌群落主要以亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)为主，施氮肥促进Nitrosospira的增长。相关性分析表明：NH4+-N与总PLFA、细菌PLFA、G+、G-、F/B、MBC、MBN及16SrRNA基因拷贝数、AOB的基因拷贝数都显著相关。因此，铵态氮是该地区微生物群落可利用的有效氮素。 综上所述，在盐碱地改良过程中施用脱硫废弃物显著的提高土壤微生物生物量，改变了微生物群落结构，对表层土壤的影响大于深层土壤。微生物群落对脱硫废弃物施用量响应的阈值约为1.49kgm-2。在施用脱硫废弃物的基础上再施用氮肥使土壤微生物生物量和功能基因群落多样性增加，而40gm-2的施氮量是促进微生物量和多样性增加的最佳施用量。脱硫废弃物和氮肥配合施用对氨氧化细菌丰度具有叠加效应。