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18F-FDG(18F-fluoro-2-deoxy-glucose),一种葡萄糖类似物,作为肿瘤代谢能量的底物而成为正电子发射断层显像（Positron Emission Tomography,PET-CT）显像剂。日常临床工作中,肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）对18F-FDG摄取率表现出很大的差异性,这一现象主要取决于细胞膜上葡萄糖转运蛋白（Glucose Transporters,GLUTs）的表达量的分布。目前报道14种GLUTs蛋白中,GLUT1分布最广,是影响肿瘤细胞葡萄糖和18F-FDG摄取的最主要转运蛋白。本研究将从炎症细胞因子白介素-6（Interleukin,IL-6）与肝细胞癌的发生发展密切关系切入,着重研究IL-6是否介导泛素E3连接酶HRD1通过内质网应激相关蛋白降解（Endoplasmic Reticulum-associated Degradation,ERAD）通路引起GLUT1蛋白降解,使细胞膜上GLUT1分布减少,削弱其转运糖的功能而影响18F-FDG摄取。本课题组以临床病例结果为研究基础,利用肝癌细胞株Huh7细胞体外培养相关实验和动物模型试验,来进一步研究IL-6与HRD1的关系以及HRD1与GLUT-1表达之间的关系,为揭开肝细胞癌PET-CT诊断中18F-FDG摄取率的不同提供科学依据,以减少肝细胞癌PET-CT诊断的误诊率。目的从炎症细胞因子白介素-6（Interleukin,IL-6）与肝细胞癌的发生发展密切关系切入,着重研究IL-6是否介导泛素E3连接酶HRD1通过内质网应激相关蛋白降解（Endoplasmic Reticulum-associated Degradation,ERAD）通路引起GLUT1蛋白降解,使细胞膜上GLUT1分布减少,削弱其转运糖的功能而影响18F-FDG摄取。方法1.收集9例肝细胞癌患者PET-CT图像资料和临床资料,免疫组织荧光实验检测临床肝细胞癌标本中癌组织GLUT1蛋白的表达情况,免疫组织化学实验检测相应癌组织内质网相关蛋白降解相关蛋白HRD1和Derlin1的表达情况。2.Western blot检测肝细胞癌、癌旁和正常组织的GLUT1蛋白表达,RT-PCR检测肝细胞癌、癌旁和正常组织的GLUT1m RNA的表达。3.常规方法培养肝细胞癌Huh7细胞,并检测IL-6体外刺激Huh7细胞24h后HRD1的变化。4.体外构建慢病毒HRD1过表达和慢病毒干扰Sh RNA-Huh7稳定细胞株,并从m RNA水平和蛋白水平进行验证。5.慢病毒HRD1过表达和慢病毒Sh RNA-HRD1稳转Huh7细胞株的体外18F-FDG的摄取率的检测。6.慢病毒HRD1过表达和慢病毒Sh RNA-HRD1稳转Huh7细胞株Balb-c裸鼠模型制作、Micro PET成像和结果分析。7.Western blot检测荷瘤鼠模型成像后瘤体组织的GLUT1、HRD1和Derlin1的蛋白水平。8.免疫共沉淀法检测Huh7细胞株的HRD1与GLUT1的相互作用。结果1.9例肝细胞癌大体标本免疫组织学结果9例肝细胞癌患者免疫组织荧光法结果显示18F-FDG中低摄取组和高摄取组中癌组织GLUT1表达量均上调,GLUT1表达量高摄取组癌组织较中低摄取组组织上调近2.30倍（P<0.05）。免疫组织化学结果显示:HRD1和Derlin1在肝细胞癌均上调,且中低摄取组HRD1和Derlin1表达量明显上调,分别是高摄取组的2.56倍和1.83倍（P<0.05）。2.IL-6体外刺激Huh7细胞引起HRD1改变的结果体外IL-6给予10 ng/ml、50ng/ml和100ng/ml体外刺激Huh7细胞24h,收集蛋白,变性,Western blot检测结果示HRD1的蛋白表达量较对照组明显增加,最高表达量可达对照组的2倍（P<0.05）。3.体外构建慢病毒HRD1过表达和慢病毒Sh RNA-HRD1Huh7稳定细胞株,并从m RNA水平和蛋白水平进行验证。QPCR结果显示HRD1过表达组较空载组HRD1表达量增高近10倍,而Sh RNA-HRD1组较空载组HRD1的量减少至少2倍（P*<0.05）。Western blot结果显示HRD1过表达细胞组HRD1表达量较对照组升高近2倍,而Sh RNA-HRD1细胞组的HRD1蛋白表达量较对照组明显减少2倍（P*<0.05）。4.四组细胞包括HRD1过表达细胞组、对照病毒组、Sh RNA-HRD1细胞株和相应对照组体外18F-FDG摄取实验结果。四组细胞结果提示:γ计数仪读取18F-FDG摄取结果Sh RNA-HRD1组（CPSavg=2130）明显高于两组空载细胞（CPSavg=1530）,**P<0.05且HRD1过表达组（CPSavg=988）明显低于两组空载细胞,重复3次,**P<0.05,HRD1-Sh RNA组葡萄糖摄取率明显高于HRD1过表达组,*P<0.05,四组细胞对18F-FDG摄取率有统计学差异。5.四组细胞Balb-c荷瘤鼠模型制作和Micro PET成像。实验结果显示:18F-FDG摄取率Sh RNA-HRD1组（SUVmaxavg=0.83）高于HRD1过表达组（SUVmaxavg=0.66）,相差约1.22倍,存在明显差异（P<0.05）。6.四组细胞Balb-c荷瘤鼠Micro PET成像后的瘤体组织蛋白检测。实验结果显示:18F-FDG摄取率Sh RNA-HRD1组（SUVmaxavg=0.83）高于HRD1过表达组（SUVmaxavg=0.66）,相差约1.22倍,存在明显差异（P<0.05）。Micro PET成像结束后将瘤体取出,Western blot检测相应GLUT1、HRD1和Derlin1的表达,其结果与临床大体病例结果基本一致。7.免疫共沉淀实验结果。采用免疫共沉淀技术检测GLUT1和过表达的HRD1有相互作用。采用免疫荧光技术GLUT1为红色荧光,HRD1为绿色荧光,两种荧光完全重叠呈橙色,验证了CO-IP的实验结果。结论1.肝细胞癌PET-CT18F-FDG摄取率与GLUT1表达量密切相关;2.肝细胞癌细胞膜蛋白GLUT1的分布与由炎症细胞因子IL-6介导的内质网应激启动的E3泛素连接酶HRD1-Derlin1复合物泛素化降解过程密切相关。目的探讨灵芝多糖（GLPS）体内抗肝癌的分子机制。方法肝癌小鼠模型测定灵芝多糖对调节性T细胞（Treg）和效应T细胞的平衡作用,实时PCR检测微小RNA（mi RNA）和m RNA水平。通过抑制增殖测定调节性T细胞对效应T细胞的增殖情况。mircro RNA-125b的（mi R-125b）抑制剂用于下调mi R-125b表达。结果灵芝多糖能显著抑制肝癌小鼠肿瘤生长与上调Teffs/Tregs的比例密切相关。此外,灵芝多糖清除Treg对Teff增殖的抑制作用与IL-2的分泌增加有关。此外,灵芝多糖治疗T细胞通过mi R-125b的表达上调从而抑制Notch1和Foxp3表达。肝癌小鼠模型中mi R-125b抑制剂能明显消除灵芝多糖对肿瘤生长的的影响。结论GLPS通过上调miR-125b抑制调节性T细胞的积累和功能从而抑制肝癌生长。这一发现为GLPS抑制肝癌生长提供了新的证据。