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碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)是最重要的磷酸酶之一,广泛存在于微生物和动物界。ALP在生物体内直接参与磷酸酶基团的转移和代谢过程,对钙质吸收、骨骼形成磷酸钙沉淀都起着重要的作用。提纯的碱性磷酸酶常用于核酸的研究,是基因工程常用的工具酶,也是酶标免疫测定的常用工具酶之一。本文以酶活力比较高的海参肠为原料,从中分离纯化碱性磷酸酶,并对其理化性质进行研究。经过Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)抽提、正丁醇处理、70%硫酸铵沉淀分离、超滤脱盐除去部分杂蛋白及盐离子、DEAE-52离子柱、Sephacryl S-200凝胶柱和Native-PAGE对样品进行分离纯化获得碱性磷酸酶,纯化后的酶经SDS-PAGE测定得到两条带,分子量约为97.2 kDa和34.7 kDa。该酶纯化倍数为20.55,比活力达到58.6 U/mg。以4-硝基苯磷酸二钠盐(p-NPP)为底物,测得该酶最适pH为10.5,最适温度为40℃,在20-30℃时有很高的稳定性。金属离子对该酶的作用效果不同,Mg2’对碱性磷酸酶有激活作用,Zn2+、Ba2+、 Sn2’和Ca2’对该酶均有不同程度的抑制作用,其中Zn2+的抑制作用最强。EDTA、 L-Phe、Na2WO4、Na2HPO4和左旋咪唑对海参肠ALP的酶活均有影响,其中EDTA和Na2WO4对ALP活力影响最大。HPO42-是碱性磷酸酶催化p-NPP的产物之一、W042-是产物类似物,30mmol/L HPO42-使酶活仅剩43.7%,而30 mmol/L WO42-使酶活仅剩41.8%。海参肠碱性磷酸酶催化p-NPP水解反应,反应的米氏常数(Km)和最大速度常数(Vm)分别为KKm=5.76 mmol/L、Vm=24.45 μmol/L·min。分别采用chloramines-T、 PMSF、 IAc、 DTT等化学修饰剂选择修饰海参肠碱性磷酸酶的多种氨基酸残基,并测定其酶活力变化。结果表明,Met、His不是碱性磷酸酶的必需功能基团,Ser可能是碱性磷酸酶的必需功能基团,二硫键对保护碱性磷酸酶的催化功能可能是必需的。