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研究目的及背景瘢痕疙瘩是临床上常见的病理性瘢痕，虽然经过长期、大量的研究，但其发病机制仍不清楚，是整形外科领域的一大难题。目前，越来越多的研究提示其发病是遗传易感基因与外源性因素共同作用的结果，故确认相关易感基因对于瘢痕疙瘩诊断和治疗具有深远意义。既往研究多集中在散发病例，因遗传变异、多态性和环境等因素影响，缺乏代表性和一致性，虽报道较多，但仍无明确结论。疾病家系具有较稳定的遗传背景和典型表型，是用来筛查易感基因最具说服力的研究对象，通过采集疾病家系标本，进行相关分子遗传学研究将有望为定位瘢痕疙瘩易感基因带来突破。瘢痕疙瘩的发病家系很少见，采集一个符合医学研究标准的家系的完整标本更属不易。对于一系列长期研究而言，一次采样多不能满足需要；加之家系成员居住分散、不能积极配合和总体费用昂贵等因素，重复采样往往十分困难，一定程度上制约了研究的开展。EB病毒是一种广泛存在的亲人类B淋巴细胞的疱疹病毒，能选择性转化人类B淋巴细胞为具有持续分裂能力的淋巴母细胞样细胞系（LCL）。因此，运用EBV转化技术建立发病家系个体的永生化细胞库，只经一次采样即可长期保存家系的完整基因信息，并提供足够的标本来源供持续研究使用，具有重大科研价值。短串联重复序列（STR）广泛存在于真核生物基因组中，是具有高度多态性的新一代遗传标记。通过家系分析和分子生物学方法，进行连锁分析和相关分析，寻找与疾病高度相关STR位点，是目前定位疾病易感基因的主要方法。经过课题组成员的共同努力，我们采集了一个较完整的瘢痕疙瘩家系的临床资料和外周血标本，运用EBV转化技术建立了其中具有显著遗传学意义个体的永生化细胞库，并针对人SMAD蛋白基因所在的15q22.31-q23及18q21.1染色体区域，选择7个微卫星标记，采用STR连锁分析方法对此家系疾病易感基因的定位进行了初步研究。材料与方法1、采集中国东北地区1个5代瘢痕疙瘩发病家系的临床资料及56人的外周血标本，其中确诊患者11例（男5例、女6例），并进行初步的遗传学分析。2、瘢痕疙瘩家系外周血淋巴细胞永生化细胞库的建立选择此家系中先证者家庭及唯一四代家庭共四代28人的外周血样本，先后应用新鲜血法和冻存血法来建立淋巴细胞永生化细胞库。新鲜血法：在无菌条件下，从外周血样本中分离出淋巴细胞，加入EBV悬液、CyA等，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。转化成功后经转瓶、传代培养，4～5代后进行冻存建株。3个月后对冻存细胞株进行复苏，常规培养、传代。冻存血法：所有血样均经液氮冻存，1月后抽取6例冻存血标本，复苏后加入EBV悬液进行转化、培养、传代。对建系前后及冻存复苏传代后淋巴细胞分别进行染色体G显带染色体核型分析，比较结果。3、瘢痕疙瘩疾病易感基因的家系连锁分析定位研究取家系中包括先证者及大部分患者家庭在内的四代32人的外周血标本提取DNA，选择位于15q22.31-q23及18q21.1区域7个微卫星标记，应用聚合酶链式反应得到扩增产物片断，电泳数据经Genescan（3.11版）、Genotyper（3.7版）软件处理后得到检测片段大小和基因型；运用连锁分析软件Linkage5.11的MLINK程序计算每个标记的LOD值，根据两点间LOD值判断连锁关系。结果与讨论1、采集到中国东北地区1个5代瘢痕疙瘩发病家系的临床资料及56人的外周血标本，遗传分析发现此汉族瘢痕疙瘩家系的遗传模式符合常染色体显性遗传伴不完全外显，但表现度存在差异，临床表型有逐代减轻趋势。2、用于建立永生化细胞库的28例样本中，27例的淋巴细胞被成功转化、培养并建系，冻存1月后的细胞株复苏成功率为100％，表明建系成功。一次建系成功率达96.4％。细胞建系前后及冻存复苏传代后分别进行染色体G显带分析未见异常条带变化，表明转化后细胞核型稳定，保留了原有遗传标志。两种转化操作方法的结果比较显示，新鲜血法的一次建系成功率为96.4％，是建立LCL的理想方法，而冻存血法转化成功率较低，可作为新鲜血法的有限补充。3、对此家系样本DNA的STR连锁分析结果显示：在外显率分别为70％和90％条件下，D15S108、D15S216、D15S534、D18S363、D18S846五个标记位点的两点LOD值在重组率θ=0时均小于-2，可以认为本家系疾病易感基因与上述五位点不存在连锁关系，而D18S460、D18S467两位点在重组率为0.05和0.10时的两点LOD值均大于1，且外显率为90％时，D18S460在θ=0得到最大LOD值=2.201，外显率为70％时，D18S467在θ=0时得到最大LOD值=1.507，均提示支持两标记位点与候选基因存在连锁关系，此家系瘢痕疙瘩易感基因可能位于染色体18q21.1区域内。结论与发现1、采集到目前最大的一个汉族瘢痕疙瘩家系的完整资料和外周血样本，初步遗传学分析表明其遗传模式符合常染色体显性遗传伴不完全外显，但表现度存在差异。2、首次将EBV转化淋巴细胞技术用于瘢痕疙瘩家系遗传信息的永久保存，成功建立了此瘢痕疙瘩家系较完整的永生化细胞库。EBV转化技术可有效地长期、稳定保存人外周血淋巴细胞的遗传信息，可用于采集更多家系样本并加以长期保存具有重大的实用价值。新鲜血法是建立LCL的首选方法，结合冻存血法的综合应用有可能获得更高的建系成功率。3、通过对此家系的STR连锁分析的初步研究，首次发现汉族人瘢痕疙瘩易感基因可能位于18q21.1区域内，初步确定SMAD2和PIAS2基因为候选基因，为后续深入研究提供了重要参考。收集更多家系标本，进行多个家系的连锁分析或全基因组扫描对于定位和克隆中国人瘢痕疙瘩易感基因具有重要价值。