环氧化合物是一类用途极广的有机化学原料和合成中间体,广泛应用于有机合成、精细化工和材料科学等领域。酶法原位产过氧酸催化环氧化反应可用于制备环氧化合物,在酶法合成中,过氧化氢通常作为反应底物和氧化剂而具有两面性:一方面作为一种理想的清洁氧源日益受到人们的重视;另一方面过氧化氢极易使酶在催化过程中损失活力,甚至可使酶完全失活。因此,提高反应中酶对过氧化氢的耐受性成为酶法催化环氧化反应的研究重点。随着现代“绿色”化学这一概念的提出,开发新型“绿色溶剂”成为研究的热点。天然低共熔溶剂因其容易制备、无毒、易降解等特点,可作为一种新型“绿色”介质引入生物催化,并逐渐引发研究者的注意。此外,研究表明天然低共熔溶剂对脂肪酶或者酯酶在生物转化过程中的催化活力有积极的作用。酶工程技术的迅速发展,为提高酶分子对过氧化氢耐受性提供了另一种策略,采用修饰酶分子表面对过氧化氢敏感的氨基酸残基的方法,可以减少反应中过氧化氢对酶分子损伤,但该策略工作量较大,在实际应用中,难以同步实现既提高酶分子对抗过氧化氢的能力又提高酶催化活力。针对上述问题,本论文采取溶剂工程和分子改造的两种策略实现酯酶/脂肪酶高效催化环氧化反应。主要研究了新型溶剂体系对催化环氧化反应效率的影响,并初步解释导致高效实现催化环氧化反应的可能原因;通过理性设计突变体,不仅提高了酯酶对抗过氧化氢损伤的性能,同时还提高了其催化过氧化活力。本论文的研究结果对酯酶/脂肪酶在工业上的利用具有重大意义,为酯酶/脂肪酶用于酶法催化环氧化反应提供了科学依据。本论文主要研究内容包括以下四个方面:(1)采用加热方法快速制备了十种天然低共熔溶剂,并通过1H NMR和13C NMR、FT-IR、DSC和TG等分析方法对其相关性质进行了表征。结果表明天然低共熔溶剂的组分之间保持相对独立,但分子间存在氢键相互作用,水分含量超过50%可破坏天然低共熔溶剂之间的氢键相互作用力。此外,天然低共熔溶剂属于低转变温度混合物,具有良好的热稳定性;水分对天然低共熔溶剂粘度有影响,天然低共熔溶剂的粘度随含水量增加而迅速降低,并证明天然低共熔溶剂及其水溶液均属于牛顿流体。(2)初步考察了不同天然低共熔溶剂体系对脂肪酶催化烯烃环氧化反应的影响,表明脂肪酶Novozym 435在含多元醇类氯化胆碱/山梨醇溶剂中底物转化率最高为72.4%。最优条件为反应温度40℃、十八烯与辛酸摩尔比例1:1和十八烯与过氧化氢摩尔比1:2,反应24 h,环氧十八烯的转化率为97%。该氧化体系可催化不同类烯烃环氧化,具有底物广谱性;并采用分子模拟探讨了脂肪酶在该体系下催化环氧化反应的机理。此外,与传统离子液体比较,氯化胆碱/山梨醇体系的E-factor是前者一半,更符合“绿色”理念发展的要求。(3)建立天然低共熔溶剂体系用于油脂环氧化反应,在氯化胆碱/木糖醇溶剂体系中的反应可获得86.7%的产物转化率,远高于对照体系8%的底物转化率,结果表明偏甘油酯脂肪酶lipase G联合天然低共熔溶剂可高效催化三油酸甘油酯环氧化。优化体系参数为:最适催化温度为40℃,最适过氧化氢与碳碳双键摩尔比例为3:1,最适溶剂与底物质量比为1:1。经1H NMR分析,验证偏甘油酯脂肪酶lipase G催化环氧化油脂反应中不存在水解副反应。经考察不同介质中lipase G二级结构的变化情况,发现在氯化胆碱/木糖醇溶剂中lipase G蛋白质结构较稳定,这可能是在该体系中实现高效催化环氧化油脂的原因。(4)分子克隆表达了四种耐热酯酶并比较其野生型耐受过氧化氢能力,其耐受过氧化氢能力从大到小的顺序为:PestE>EST1>AFEST>TTEST。以提高底物与催化活性位点结合的能力为目的,并联合改变催化活性位点疏水性区域的策略。本研究对酯酶PestE进行理性设计获得9个突变体,与野生型比较,双突变体L89R/L40A耐受过氧化氢的能力明显提高,过氧化酶活力提高3倍,底物选择性提高80倍,温度耐受性提高2倍,催化环氧化油酸的效率提高约2倍。比较传统取代酶分子表面易被氧化氨基酸方法,该策略具有指导意义。