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在课题组前期研究的基础上,我们发现中药复方开心散具有显著的减轻慢性应激压力(CUMS)模型小鼠抑郁样行为的作用。对中外文献调研的过程中,我们发现慢性压力应激导致的下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal,HPA)轴过度激活,打破肠道菌群组成平衡状态,导致炎症因子大量产生,破坏肠道屏障,增加血脑屏障通透性,导致中枢神经炎症的发生。以上过程可能在抑郁症的发病环节中起重要影响。因此本论文拟采用CUMS模型评价开心散调控肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统抗抑郁效用,比较开心散不同配伍比例的作用差异。进而根据上述系统构建细胞模型筛选功效物质。基于筛选所得的有效成分,进行配伍组合优化比例,获得开心散功效组分并采用整体动物实验验证其抗抑郁效用。本论文以首先从整体动物层面揭示效用、进而根据作用机制建立细胞模型筛选功效物质、最终获得功效组分再回归整体动物模型进行验证的研究思路进行。论文分为五个章节,主要研究的内容摘要如下:一、文献研究1.对抑郁症临床的发病率、危害性和用药情况,抑郁症病理机制的认识与肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症三大系统在抑郁症病理机制中的作用及相互关系进行综述。2.对中药复方治疗抑郁症的研究进展进行综述。3.对开心散方剂的源流和现代研究进展进行综述。二、通过肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统阐明开心散抗抑郁作用机制1.开心散抗抑郁效用评价本节采用CUMS模型小鼠作为研究对象,通过行为学评价,如糖水偏嗜实验(SPT)、强迫游泳实验(FST)、悬尾实验(TST)、开场实验(OFT),发现开心散的不同配伍比例均有减轻动物抑郁样行为的功效,其中以人参、远志、石菖蒲、茯苓配比为3:2:2:3(D-652)的开心散配伍比例抗抑郁效用最佳。2.开心散调控脑-肠轴作用机制研究本节分为三部分。第一部分考察了开心散调控肠道微生态抗抑郁的作用机制。以CUMS模型小鼠的小肠、粪便作为待测生物样本,采用了酶联免疫吸附(ELISA)法检测小肠组织中的炎症因子表达情况,发现开心散降低模型小鼠小肠组织炎症因子的表达。我们还发现模型出现小鼠肠道菌群结构失衡,革兰氏阴性菌相对丰度增加、肠道屏障受损等肠道微生态紊乱现象,而开心散各配伍比例可以降低革兰氏阴性菌的相对丰度,上调屏障蛋白表达,以D-652的效用最佳。第二部分选取CUMS动物的脑组织和血清样本进行研究,发现开心散能够显著下调模型小鼠血清和脑中炎症因子的表达,同时也能够上调血脑屏障蛋白表达,显示其具有抑制中枢神经炎症的作用。第三部分以CUMS模型小鼠HPA轴相关组织,如下丘脑、肾上腺、海马区、血清,测定压力因子表达。结果发现开心散可以下调模型动物组织和循环中压力因子表达,显示其具有抑制压力应激导致的HPA轴过度激活的作用。三.开心散调控肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统的功效验证在CUMS模型构建的同时给以抗生素,改变小鼠肠道菌群组成结构,给以开心散并检测行为学变化。进而采集生物样本检测与三大系统相关的各项因子并结合肠道菌群分析,发现开心散调控三大系统的抗抑郁作用能被抗生素所削弱,提示肠道微生态的调控是开心散实现其抗抑郁效用的重要环节。四、基于细胞模型筛选开心散抗抑郁功效物质1.基于肠道炎症模型的功效物质筛选本节采用小鼠巨噬细胞细胞系(RAW264.7)和小鼠结肠上皮隐窝细胞系(IEC-6)作为细胞模型,分别检测在LPS刺激作用下,开心散对炎症因子与肠道屏障蛋白表达的影响,发现人参皂苷Rg1可能为基于该环节的功效物质。2.基于中枢神经炎症模型的功效物质筛选本节采用小鼠小胶质细胞系(BV2)与原代小鼠皮层星形胶质细胞(MCAST),检测在LPS刺激作用下开心散对炎症因子与血脑屏障蛋白表达的影响。采用小鼠海马神经元细胞系(HT22)作为中枢炎性损伤保护的细胞模型,检测在TNF-α损伤下开心散对细胞存活的保护作用。发现石菖蒲中的细辛醚成分以及人参皂苷类成分是基于此系统的功效物质。3.基于压力应激模型的功效物质筛选本节采用大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞细胞系(PC12)和人神经母细胞瘤细胞系(SHSY-5Y),检测了开心散对压力因子皮质醇(Cortisol)损伤细胞的保护作用。通过对细胞存活率进行检测,发现在压力应激模型上细胞保护作用趋势最强的物质为来源于远志的远志口山酮III、来源于石菖蒲的细辛醚类与茯苓的三萜酸类成分。五、通过组分配伍,在整体动物模型上验证开心散的功效物质基础基于上述的细胞模型筛选结果,我们选择了四种分别来源于四味药材的单体化合物:人参皂苷Rg1、远志口山酮Ⅲ、α-细辛醚、茯苓酸。采用悬尾与强迫游泳模型,利用正交试验优化组分配比。然后在CUMS动物模型上进行验证,发现该组分配伍具有显著的抗抑郁效用,与开心散原方作用相当且具有量效关系。本研究对开心散抗抑郁的功效物质基础进行了积极探索,揭示了其抗抑郁的功效物质。