论文部分内容阅读
对虾白斑症病毒(WSSV)病是危害养殖对虾最严重的病害之一,自该病1993年暴发以来,在对其病原、病理、检测及诊断技术等方面的研究上取得了诸多成果。目前,研究WSSV感染的分子机理,寻求防控WSSV感染的方法已成为热点。已有研究表明WSSV-VP28在WSSV的感染入侵过程中起着非常重要的作用。论文纯化了前期制备的具有中和WSSV特性的抗VP28单克隆抗体(单抗)1D6(Abl),并以之为抗原免疫小鼠,研制抗VP28独特型单抗(Ab2)杂交瘤细胞,利用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)和竞争ELISA,从中筛选到一株单抗A1A5,该单抗能与WSSV竞争结合抗VP28抗体；以抗-抗独特型抗体(Ab3)进一步分析单抗A1A5的特性,证实了单抗A1A5是能模拟VP28的抗VP28独特型单抗；利用研制的抗VP28独特型单抗研究了VP28与宿主细胞间的相互作用,检测了VP28与中国对虾组织的结合,鉴定了VP28在中国对虾血细胞上的结合蛋白,为进一步确认VP28在WSSV感染中所起的作用,深入研究WSSV感染机理,切断WSSV感染途径提供新的依据。具体研究内容和结果如下：(1)抗VP28独特型单抗的研制。以前期已制备的具有中和WSSV特性的抗VP28单抗1D6杂交瘤细胞生产腹水,腹水依次经辛酸-硫酸铵法和Protein G亲和层析纯化,获得了纯度高、有活性的抗VP28中和单抗并用以免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,研制抗VP28独特型单抗杂交瘤细胞,采用间接ELISA和竞争ELISA方法从杂交瘤细胞中筛选抗VP28独特型单抗,克隆得到1株抗VP28独特型单抗A1A5能识别抗VP28抗体,并能与WSSV竞争结合抗VP28抗体,初步证实单抗A1A5能模拟VP28的抗原构象。(2)以抗-抗独特型抗体分析抗VP28独特型单抗的特性。为了进一步确认单抗A1A5的特性,以A1A5杂交瘤细胞生产腹水,腹水经辛酸-硫酸铵法和ProteinG亲和层析纯化,获得纯化抗体用以免疫BALB/c小鼠制备抗血清,得到Ab3；采用间接免疫荧光分析(IIFA)、金标免疫电镜法(IEM)、竞争ELISA和螯虾体内中和实验多种方法分析了Ab3特性。IIFA证实Ab3可与感染WSSV的虾鳃反应；IEM结果显示Ab3可与WSSV结合,其结合位点位于WSSV囊膜上；竞争ELISA表明Ab3能与抗VP28抗体竞争结合WSSV上结合位点；以螯虾体内中和实验分析Ab3中和性,注射与Ab3孵育后WSSV的螯虾与仅注射WSSV的螯虾相比,其死亡时间明显延迟,证实Ab3能中和WSSV感染。以上结果说明了由Ab2免疫产生的抗体Ab3具有与类似Ab1特性。因此,根据抗独特型抗体理论推断,单抗A1A5是能模拟VP28的抗VP28独特型单抗。(3)抗VP28独特型单抗的应用。论文在成功研制抗VP28独特型单抗的基础上,利用抗VP28独特型单抗探讨了wSSv囊膜蛋白VP28与宿主细胞之间的相互作用关系。中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞与单抗A1A5孵育,再以荧光二抗染色,在中国对虾血细胞膜上可见黄绿色荧光,结果表明单抗A1A5能与中国对虾血细胞膜结合,中国对虾血细胞膜上存在VP28的受体蛋白。以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗WSSV混合单抗,建立了基于斑点免疫印迹(Dot-blot)和ELISA的WSSV与血细胞膜体外结合实验体系,提纯的血细胞膜固定于NC膜或酶标板上,将单抗A1A5或抗中国对虾血细胞颗粒单抗1G8与中国对虾血细胞膜作用后,再与WSSV孵育,结果显示A1A5组的WSSV结合量明显低于1G8组,单抗A1A5与中国对虾血细胞膜的结合能部分阻断WSSV与中国对虾血细胞膜的结合,这为证明VP28是WSSV感染相关的重要蛋白提供了新的依据。以IIFA和免疫组织化学方法(IHC)检测单抗A1A5与中国对虾各组织的结合,发现单抗A1A5可以与中国对虾鳃和肠组织结合,而不与肌肉、性腺、心脏、肝胰腺等组织结合,推断中国对虾鳃和肠组织中存在VP28的受体蛋白。以免疫共沉淀鉴定VP28在中国对虾血细胞上的结合蛋白,单抗A1A5可与中国对虾血细胞膜上分子量为47 kDa的蛋白结合,该蛋白可能是VP28在中国对虾血细胞膜上的受体蛋白。本论文为WSSV感染相关蛋白、分子机理以及预防控制研究提供了新的研究工具和研究方法。