目的:大黄素是一个来源于多种植物及微生物的蒽醌类化合物,具有利尿、抗炎以及抗病毒的药理活性,有较高的药用价值。由于植物提取大黄素耗时费力并且成本较高,随着合成生物学的发展,通过生物合成的方法在工程微生物中异源合成大黄素已成为可能的替代方案。脱羧酶是通过脱羧作用把大黄素前体物质atrochrysone carboxylic acid(ACA)催化为终产物大黄素,是大黄素生物合成途径中关键的最后一步。因此,本论文以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BJ5464-NpgA为宿主,首先根据大黄素生物合成途径构建能够产生ACA的菌株,再对不同来源的脱羧酶同工酶进行活性筛选,找到活性最高的脱羧酶AfDC,探究其高效催化的机制,并进一步通过蛋白模拟和分子对接等方法,结合分子生物学实验数据,建立可信度较高的酶蛋白结构和底物结合的模型,深入了解脱羧酶的结构与催化效率的关系,为脱羧酶的分子改造提供一定的参考。方法:1构建产生ACA的工程菌株通过异源表达,重构ACA生物合成途径,应用Cre/loxP技术使其同源重组到BJ5464-NpgA(BJ5464)宿主细胞的基因组中,构建能够稳定产生ACA的工程菌株。2脱羧酶基因筛选及重要氨基酸探究根据NCBI数据库通过序列比对筛选来自Group VNR-PKS基因簇中不同来源的脱羧酶同工酶,通过酵母体内催化ACA脱羧反应生产大黄素的方法检测脱羧酶的催化效率,筛选出最高效率的脱羧酶。为了深入探究脱羧酶的高效催化机制,根据蛋白序列比对结果,预测一系列潜在影响催化效率的非保守重要氨基酸位点,通过定点突变探索影响脱羧酶高效催化机制的重要氨基酸。3脱羧酶分子模拟通过在线网站I-TASSER对筛选出的活性最高的脱羧酶进行同源建模,预测脱羧酶的三维分子结构,再通过软件GuassView自行绘制ACA的三维分子结构。运用软件Autodock对脱羧酶三维结构和ACA进行分子对接,通过分子模拟分析脱羧酶的高效催化机制。结果:1获得了稳定产生ACA的工程菌株把ACA生物合成途径中的关键酶乙酰辅酶A羧化酶、聚酮合酶和硫酯酶连接至表达载体pXP418和pCEV-G4-Km,并通过Cre/loxP技术整合入S.cerevisiae BJ5464-NpgA 基因组中,成功构建菌株 sLY2(BJ5464-ACC1**-SlACAS-HyTE),作为产生ACA的工程菌株。2筛选出脱羧酶中的8个重要氨基酸比较7个不同来源的脱羧酶同工酶的脱羧效率,分别是HyDC、TpcK、AfDC、PsDC、TaDC、PaDC和ThDC,其中,脱羧酶HyDC的脱羧效率最高,脱羧酶PsDC的脱羧效率最低。根据氨基酸定点突变筛选出影响脱羧酶高效催化的8个重要氨基酸,分别是 Lys7、Arg10、Ala61、Arg63、Ala67、Glu68、Ser72 和 Glu89,其中,Arg63影响最大,无效突变后转化率为15.19±1.88%,降低了 80%左右(P<0.01),与空白对照的脱羧效率相差无几,在脱羧反应的进程中发挥着至关重要的作用,而Lys7、Arg10、Ala61、Ala67、Glu68、Ser72和Glu89对脱羧酶高效催化影响中等,定点突变后转化率仅降低了 50%左右(P<0.01)。3脱羧酶分子模拟结合定点突变的酶活实验结果,以3hfkB为模板,通过同源建模预测出脱羧酶三维分子结构,通过分子对接分析脱羧酶蛋白分子中重要氨基酸的功能,我们建立了可信度较高的蛋白酶和底物结合的模型。氨基酸Lys7、Arg10和Glu89聚集在一起形成底物ACA的入口处,并且Lys7和Arg10处在α螺旋,Glu89处在α螺旋和β折叠的拐角处,均处在蛋白的骨架结构中,使底物的入口处更加稳定牢固。氨基酸A1a67、Glu68、Ser72聚集在一起呈现出明显的正电区域,与大黄素前体分子形成静电吸引,稳定脱羧酶与大黄素前体分子的结合,而氨基酸Arg63在此稳定结合的环境中能够形成氢键,对脱羧进程有着直接的催化作用。结论:本研究针对大黄素生物合成途径,筛选出影响脱羧酶高效催化的8个重要氨基酸,其中Arg63为关键氨基酸,不但丰富了脱羧酶结构与功能的关系,而且为进一步的酶分子改造提供一定的参考。