由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起的乙型肝炎是严重危害人类健康的疾病，其主要危害性在于HBV在患者体内的持续性存在易引起慢性肝炎、肝硬化，并与肝细胞癌的发生密切相关。α-干扰素(Interferon-α，IFN-α)是最早、也是目前最常用的治疗乙型肝炎的药物之一，通过诱导一系列具有抗病毒作用的效应蛋白的表达，在细胞内建立起抗病毒状态，抑制病毒复制。临床资料表明IFN-α能下调病毒蛋白表达，调节免疫反应，促进抗体产生，但其单独治疗时仅30～40％的患者有较好应答。这些现象提示HBV能够拮抗IFN-α的抗病毒效应。对于HBV拮抗IFN-α的抗病毒效应的具体机制，近年来国内外众多实验室进行了研究并已获得具有一定意义的结果，如发现HBV多聚酶蛋白可干扰IFN的信号通路，抑制干扰素诱生基因的表达；慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞MxA蛋白诱生障碍，进一步研究发现HBV前Core或Core蛋白可结合MxA基因上游启动子，从而抑制MxA蛋白表达。以上结果提示HBV与IFN-α间存在相互作用，可以推测HBV可能通过对干扰素效应信号通路中的关键环节进行干预，抑制干扰素诱生的抗病毒基因的表达，从而导致感染慢性化以及对IFN-α的治疗不敏感。 为了研究HBV与IFN系统间的相互作用，本课题组曾利用cDNA微点阵芯片分析了HepG2细胞和来源于HepG2细胞并整合有HBV基因组的HepG2.2.15细胞经IFN-α处理6h前后基因表达谱的差异。结果发现，IFN-α诱导的髓样细胞分化蛋白(MyD88)的基因表达在有HBV复制的HepG2.2.15细胞中明显下降。用抗HBV药物Lamivudine或Adefovir处理HepG2.2.1 5细胞后，IFN-α诱导MyD88基因的表达出现了显著的上调。这些结果提示了HBV可能抑制IFN-α诱导的MyD88基因的表达。MyD88是介导先天性免疫中Toll样受体(TLRs)信号转导通路的一个关键分子，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，且我们的工作已证实MyD88作为IFN-α诱导的效应蛋白，能够有效的抑制HBV的复制。因此，HBV可能通过抑制IFN-α诱导MyD88基因的表达，影响IFN-α介导的抗病毒反应。深入研究HBV抑制IFN-α诱导MyD88表达的机制有可能有助于加深对HBV拮抗干扰素信号通路机制的认识。 为此，本研究首先构建了MyD88启动子报告质粒，用以筛选发挥主要抑制效应的病毒蛋白。将MyD88启动子报告质粒和HBV各蛋白的表达质粒共转Huh7细胞，结果显示HBV多聚酶蛋白可抑制IFN-α诱导的MyD88启动子活性，且抑制效应表现出剂量依赖的特异性。因此，本研究将进一步的研究重点集中于HBV多聚酶蛋白。将多聚酶蛋白各区段的突变体与MyD88启动子报告质粒共转染细胞，发现末端蛋白(TP)区域在抑制IFN-α诱导的MyDS8启动子活性中发挥了比较重要的作用。通过对MyDS8启动子区-545-+55bp序列进行生物信息学分析，发现-70至-50bp区域含有Stat和IRF的结合位点。对MyDS8启动子区进行突变分析发现Stat结合域对于IFN-α的诱导MyD88启动子活性十分重要。进一步将HBV多聚酶蛋白的表达质粒与突变的MyD88启动子报告质粒共转染细胞发现HBV多聚酶蛋白是一个有效的Stat信号通路抑制因子。在此基础上，本研究探讨了HBV多聚酶蛋白抑制Stat信号通路的可能机制。染色质免疫共沉淀结果显示，多聚酶蛋白可以抑制IFN-α诱导的Statl DNA结合能力。进一步检测Stat1 701位酪氨酸、727位丝氨酸的磷酸化水平是否发生变化，结果显示Stat1的磷酸化激活未受影响。对细胞内Stat1蛋白水平的检测显示多聚酶蛋白也不促进Stat1的降解。为此本研究进一步关注了Stat1的入核过程是否受到了影响。免疫荧光和细胞核浆组分分离的实验显示，多聚酶蛋白可以抑制IFN-α诱导的Stat1入核。以上结果初步表明HBV抑制IFN-α诱导的MyD88表达的可能机制为：HBV多聚酶蛋白通过阻碍Stat1的核内转移，降低MyD88启动子的转录活性，从而抑制了IFN-α诱导的MyD88蛋白的表达。 鉴于Stat1信号通路在IFN-α诱导效应基因表达中的重要作用，HBV多聚酶蛋白干扰Stat1核内转移的效应可能并不只局限于抑制MyD88的表达，其他的IFN-α刺激基因的表达也可能受到影响。为了验证HBV多聚酶蛋白对Stat1信号通路的抑制效应是否具有普遍意义，本研究进一步检测了HBV多聚酶蛋白对ISRE报道质粒活性以及Stat1、ISG15这两个IFN-α诱生蛋白的表达水平的影响。结果显示，ISRE报道质粒的活性及Stat1、ISG15蛋白的表达水平均受到了抑制，提示HBV多聚酶蛋白干扰Stat1的核内转移这一机制可能为HBV抑制IFN-α作用的重要环节之一。 综上所述，本研究结果发现HBV多聚酶蛋白可通过阻碍Stat1的核内转移，降低MyD88启动子的转录活性，从而抑制了IFN-α诱导的MyD88蛋白的表达。并且此机制具有普遍的适用性，可能为HBV拮抗IFN-α诱导的抗病毒效应的主要策略之一。对HBV多聚酶蛋白抑制Stat1入核具体机制的深入研究将揭示HBV拮抗干扰素的分子机制，并可能为优化临床治疗方案提供理论依据。