【摘 要】
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高等脊椎动物依靠免疫系统来抵抗病原微生物的侵袭,其免疫系统分为天然免疫系统和获得性免疫系统。天然免疫又称为先天免疫或固有免疫,能够为宿主提供迅速但非特异性的免疫保
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高等脊椎动物依靠免疫系统来抵抗病原微生物的侵袭,其免疫系统分为天然免疫系统和获得性免疫系统。天然免疫又称为先天免疫或固有免疫,能够为宿主提供迅速但非特异性的免疫保护;天然免疫系统存在于所有动植物中。鱼类同时具有这两种免疫系统,但其更依赖天然免疫抵抗病原微生物的入侵。干扰素(IFN)是一类小分子的细胞因子,在高等脊椎动物中的天然免疫和获得性免疫中均发挥关键作用;在鱼类中,干扰素对宿主抵抗病毒也是至关重要的。三倍体湘云鲫的抗病能力远强于其亲本二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤。本实验室对三倍体湘云鲫的天然免疫系统展开了广泛研究,力求阐明湘云鲫抗病力强的机制。我们的前期工作已经克隆了两种湘云鲫I型干扰素(即3nIFNa和3nIFNa2),构建了其重组表达质粒并在真核细胞中成功表达了 3nIFNa及3nIFNa2,并且实验结果证明3nIFNa是分泌出胞的细胞因子,而3nIFNa2为一种胞内细胞因子。在本文中,我们对3nIFNa和3nIFNa2在宿主抗病毒天然免疫反应中的功能机制进行了探究,具体研究内容和结果如下:1.分别用鲤春病毒血症病毒(SVCV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)和PBS缓冲液注射湘云鲫,采用实时定量PCR(q-PCR)检测3nIFNa和3nIFNa2在上述湘云鲫心脏、表皮、脾脏、肾脏、肠、肝脏、鳃等组织中的mRNA表达水平。结果显示SVCV和GCRV感染组中3nIFNa和3nIFNa2的转录水平显著高于对照组;该结果说明3nIFNa和3nIFNa2均参与了宿主抗病毒天然免疫反应。2.制备和收集含3nIFNa的细胞上清液对EPC细胞进行预孵育,之后采用SVCV和GCRV分别感染上述EPC细胞。结晶紫实验和噬斑实验结果显示:实验组细胞病变效应(cytopathic effect/CPE)远低于对照组;实验组细胞中的病毒滴度显著低于对照组细胞中的病毒滴度。3.分别在EPC细胞中表达3nIFNa和3nIFNa2;之后分别采用SVCV及GCRV分别感染上述EPC细胞。结晶紫实验和噬斑实验结果显示:实验组细胞CPE远低于对照组;实验组细胞中的病毒滴度显著低于对照组细胞中的病毒滴度。4.糖苷酶消化实验表明3nIFNa2具有N-连接糖基化修饰;其糖基化位点为177氨基酸位点的天冬酰胺。构建了其非糖基化突变体3nIFNa2-N177Q,蛋白印迹杂交实验表明3nIFNa2-N177Q也为非分泌蛋白。结晶紫实验和噬斑实验结果表明3nIFNa2-N177Q具有野生型3nIFNa2类似的抗SCVC及GCRV的能力。
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