论文部分内容阅读
目的:急性B淋巴细胞白血病(B acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)是儿童最常见的血液恶性肿瘤。目前的治疗方式以传统化疗为主,但由于化疗药物具有严重的毒副反应以及化疗耐药的出现,靶向治疗现已经成为B-ALL治疗的研究热点。在我们对B-ALL患儿差异蛋白组学的前期研究中,发现高危组患儿中热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)的表达明显高于低危组,有研究报道Hsp90在急性白血病中的高度表达与病情进展及预后密切相关。Hsp90抑制剂因其对肿瘤细胞具有高度的选择特异性而成为肿瘤治疗的研究热点。17-DMAG(Alvespimycin)为一种亲溶酶体的Hsp90抑制剂,在成人晚期实体瘤、淋巴瘤、急性髓细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病中已经进入临床I期试验,但在B-ALL的治疗研究中少有报道,其作用机理也尚不明确,故而我们选用17-DMAG作为B-ALL治疗的候选药物进行研究。随着对白血病发病机制的深入研究,调节自噬-溶酶体降解途径的进程成为当前白血病治疗研究的一个突破点。在本论文的研究中,我们选用Hsp90抑制剂17-DMAG,探讨其对B-ALL细胞增殖与凋亡的影响,并初步探讨17-DMAG通过调节自噬-溶酶体降解系统诱导细胞凋亡的潜在机制。研究方法:1、细胞增殖检测(MTS):B-ALL体外细胞株Nalm6和Reh在不同浓度的17-DMAG(0.01,0.1,1,10,100μM)处理24h、48h、72h后,采用MTS法检测细胞的增殖情况。2、细胞凋亡检测:不同浓度的17-DMAG(1μM、10μM)处理白血病细胞后,应用流式细胞术分析细胞的凋亡情况(Annexin V-FITC/PI双染法)。3、自噬水平检测:B-ALL细胞株Nalm6和Reh经17-DMAG(1μM)处理后,检测细胞巨自噬水平及分子伴侣介导的自噬(CMA)水平。蛋白免疫印迹法检测巨自噬标志物LC3B II及P62的表达量变化,同时检测分子伴侣介导自噬的伴侣分子Hsc70与受体Lamp2a的表达水平。活细胞自噬体染色检测细胞自噬体的数量。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析Hsc70及Lamp2a的mRNA表达水平。4、溶酶体数量及功能检测:17-DMAG(1μM)处理B-ALL Nalm6和Reh细胞(2h、12h、24h)后进行溶酶体染色(Lyso-Brite),荧光显微镜下观察17-DMAG对细胞溶酶体数量的影响。蛋白免疫印迹法检测17-DMAG处理细胞后溶酶体内酸性水解酶cathepsin D的蛋白表达水平。5、细胞转染:在Nalm6与Reh细胞中,通过对siRNA敲减Hsc70表达,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及共聚焦显微镜显像分析Hsc70与溶酶体酸性水解酶cathepsin D基因和蛋白的表达量变化。蛋白免疫印迹法检测泛素-蛋白酶体降解进程阻断后,17-DMAG对细胞溶酶体酸性水解酶cathepsin D蛋白表达的影响。结果:1、17-DMAG抑制白血病细胞增殖:17-DMAG以时间剂量依赖性的方式抑制B-ALL细胞株Nalm6和Reh细胞的增殖。2、17-DMAG诱导白血病细胞凋亡:17-DMAG诱导Nalm6和Reh细胞凋亡,凋亡率与药物剂量呈正相关(P<0.01)。3、17-DMAG阻滞白血病细胞自噬流:17-DMAG处理细胞早期(0h-4h)巨自噬呈低水平状态,随着处理时间的延长LC3B II与P62蛋白表达同步增加,提示处理晚期(4h-24h)自噬流受阻。自噬体数量于17-DMAG处理早期(2h)无明显改变,晚期(24h)显著增加。CMA的伴侣分子Hsc70基因和蛋白表达上调并随处理时间的延长逐步增加,24h时达到表达高峰(P<0.01)。但同时期未检测到CMA受体Lamp2a的基因及蛋白表达上调,提示CMA水平不变。4、17-DMAG抑制溶酶体降解功能:溶酶体染色显示17-DMAG处理后无明显变化,提示17-DMAG诱导自噬体堆积,而未引发溶酶体数量改变。蛋白免疫印迹法检测到溶酶体内酸性水解酶cathepsin D经17-DMAG处理后表达下调,进一步表明溶酶体内降解功能存在障碍。5、17-DMAG诱导Hsc70高表达,下调cathepsin D表达:在mRNA表达水平上,17-DMAG诱导的Hsc70高表达同时下调了Nalm6细胞cathepsin D的表达(P<0.05),但Reh细胞未受影响。Hsc70敲减后及敲减后给予17-DMAG处理不改变cathepsin D表达;蛋白水平上,17-DMAG诱导Hsc70高表达同时下调Nalm6(P<0.01)和Reh细胞(P<0.05)cathepsin D表达。应用蛋白免疫印迹法,我们检测到泛素-蛋白酶体降解进程被抑制后,17-DMAG引发的cathepsin D表达下调有所恢复,表明Hsc70诱导高表达后增加了对cathepsin D的蛋白降解,提示在两株细胞中Hsc70均参与cathepsin D翻译后的调控。结论:本研究在细胞水平上证实了17-DMAG可诱导B-ALL细胞株凋亡。17-DMAG在药物发挥效应早期抑制B-ALL细胞巨自噬水平,晚期通过诱导溶酶体内酸性水解酶cathepsin D降解导致自噬流受阻,引发细胞凋亡;17-DMAG诱导Hsc70高表达参与溶酶体酸性水解酶cathepsin D经泛素-蛋白酶体降解的过程。