放射性脑损伤（radiation injuries of brain,RIB）是脑组织受到射线照射后发生的直接、继发损伤。临床上多见于原发或继发的头颈部肿瘤放疗后,放疗是头颈部肿瘤尤其是鼻咽癌（NPC）的主要治疗手段,射线在杀伤肿瘤组织的同时,对瘤体周围的正常脑组织也会造成损伤,因此鼻咽癌放疗晚期常会发生RIB的并发症,发生率可高达28.5%^[1]。RIB形成且产生临床症状时已属不可逆阶段,其难治性严重影响患者生活质量,给患者家庭和社会带来沉重负担。RIB发病的机制尚不明确,目前的主要研究方向集中在血管损伤、神经元及神经干细胞（neural stem cells,NSCs）损伤、免疫效应等方面。目前临床上传统的药物治疗如脱水、降颅压、营养神经及对症支持等治疗效果欠佳。姜黄素（curcumin）为多酚类物质,提取自姜黄干燥的梗茎中。大量研究表明,姜黄素在体内具有多种分子靶标和信号途径,具有抗氧化、抗炎症、清除自由基等多种生物活性,并且有显著安全性和多向神经保护潜能。近年来姜黄素已成为国内外的研究热点,涉及的领域也越来越广泛^[2],虽然目前关于姜黄素对放射性脑损伤保护作用机制的研究仍处于起步状态,但已经明确了它的保护作用。Notch信号系统是进化过程中高度保守的信号传导途径,在生物发育过程中起重要作用,决定着细胞的命运。Notch信号通路通过“旁分泌”作用于临近的细胞,调控几乎所有的组织和器官的细胞增殖、分化和凋亡,间接调节神经元、血管内皮细胞发育过程。Notch信号系统在心脑血管、细胞生物学、神经生物学等多领域成为热点,主要作用机制为受体与配体结合,在细胞内发生相关的信号传导反应,最终使细胞向其他细胞分化或继续增值,整个过程调节机制复杂、与其他通路联系广泛^[3]。学习与记忆是中枢神经系统的复杂高级智能活动,与其有关的结构涉及海马、颞叶、杏仁核、间脑等边缘系统。放射性脑损伤早期主要的临床表现为学习能力与记忆力下降,脑损伤的程度越重,放疗后存活时间越长,学习记忆能力的下降就越明显,严重降低患者的生活质量。放射性脑损伤引起的学习与记忆力下降目前仍没有特异性的治疗方法,急需有效的治疗方法。血脑屏障（blood brain barrier BBB）是脑的血管壁与神经胶质细胞共同构成的血与脑细胞间的屏障和由脉络丛构成的血与CSF间的屏障,这些屏障的存在能够限制物质在血液与脑脊液及脑细胞之间的交换,可以减少血液循环中有害物质损伤脑部,维持脑内环境的稳定,同时也能清除进入脑组织内有毒物质以及脑组织内的代谢产物,对维持中枢神经系统正常结构和生理功能必不可少的。放射性脑损伤患者BBB受损,通透性增加,对神经系统保护作用减弱,病理条件下有害物质进入脑内,加重脑组织损伤。为阐明姜黄素对放射性脑损伤的保护作用,了解Notch信号通路与姜黄素神经保护作用之间的关系,离体实验用C17.2神经干细胞（C17.2NSCs）建立NSC放射性损伤模型,给予姜黄素分别与应用DAPT阻断Notch通路的C17.2NSCs及射线照射后的C17.2NSCs细胞,检测细胞的增殖与分化情况及Notch信号通路下游基因即Notch1,RBP-?κ,Hes1,Hash1基因的表达,有望阐明Notch信号通路与姜黄素途径之间的相互作用及其机制以及放射性脑损伤的复杂病理过程。根据离体实验结果,建立放射性脑损伤全脑照射动物模型,并给予不同剂量姜黄素进行干预治疗,以Morris水迷宫及跳台逃避实验检测其学习记忆能力的改变,通过脑组织中伊文思蓝（EB）含量及海马GFAP、CNPase的表达观察姜黄素对RIB大鼠血脑屏障的保护作用,为临床治疗提供依据。实验目的1.建立C17.2NSC放射性损伤模型,观察Notch通路下游节点分子Notch1,RBP-?κ,Hes1,Hash1不同时期表达情况的差异。2.姜黄素参与对C17.2NSC保护时,检测以上节点分子在不同时段的表达情况。3.加DAPT后观察放射损伤的C17.2NSC各时间点的增殖、分化、凋亡等情况。4.建立RIB模型鼠,通过对对照、模型以及采用不同剂量姜黄素治疗的RIB大鼠,以Morris水迷宫及跳台逃避实验检测姜黄素对其学习记忆能力的影响。5.姜黄素参与对RIB模型鼠保护情况下,取模型鼠脑组织行伊文思蓝（EB）含量检测,行HE染色、免疫组化染色观察海马GFAP、CNPase表达,并进行GFAP、CNPase免疫组化灰度值分析。研究方法1.C17.2神经干细胞常规培养2.C17.2神经干细胞Nestin免疫组化染色3.MTT法检测细胞活性4.放射诱导C17.2CNS凋亡及姜黄素、DAPT对的影响5.各种蛋白表达检测:（1）细胞免疫化学荧光染色（2）提取细胞总蛋白并检测含量（3）Western Blot检测6.Notch信号通路参与姜黄素抑制放射诱导的C17.2神经干细胞凋亡的信号途径研究7.活体实验（1）建立RIB模型鼠后,给予不同剂量姜黄素干预治疗（2）Morris水迷宫及跳台逃避实验（3）检测脑组织中伊文思蓝（EB）的含量（4）HE染色、免疫组化染色观察GFAP、CNPase表达结果1.对照组的细胞活性高于各照射组,加入姜黄素后,不同浓度姜黄素之间,各组之间P<0.05,姜黄素浓度在0.5umol/L、2.5umol/L、12.5umol/L时较单纯辐射组MTT OD值高,各组间两两比较,差异均有统计学意义（p<0.05）,姜黄素浓度在2.5umol/L时抑制凋亡作用最强,62.5umol/L时细胞活性显著降低（P<0.05）,提示高浓度姜黄素抑制NSC活性。2.DAPT各浓度组比对照组细胞增殖能力低,说明DAPT抑制神经干细胞的增殖,MTT OD值随着DAPT浓度增高而降低,即细胞的生长抑制程度增加。加入2.5umol/L姜黄素后与相应浓度DAPT比较,细胞增殖能力增加,各组均有统计学意义,说明姜黄素能够减轻DAPT对神经干细胞的抑制作用。3.不同浓度DAPT+射线组与对照组比较神经干细胞增殖显著降低,不同浓度DAPT组间比较,差异均有统计学意义,不同浓度DAPT+射线组与相应浓度DAPT+射线+姜黄素组比较,差异均有统计学意义。4.各处理组与对照组比较,细胞凋亡率差异显著,均有统计学意义;不同浓度DAPT组间比较,细胞凋亡率不同,差异有统计学意义;辐射+姜黄素组与单纯辐射组比较差异有统计学意义,姜黄素抑制射线引起的细胞凋亡;单纯DAPT组较辐射+DAPT组细胞凋亡率低,相应浓度间差异有统计学意义。5.神经干细胞免疫荧光染色显示Hes1、RBP-?κ蛋白。6.Western结果显示,辐射组,神经干细胞RBP-?κ蛋白的表达在姜黄素浓度为2.5 umol/L时最低,但随DAPT浓度的升高逐渐升高,Hes1蛋白含量在姜黄素浓度为2.5 umol/L时最高,随DAPT浓度升高而逐渐降低;辐射+DAPT+姜黄素较相应浓度的辐射+DAPT组RBP-?κ的表达低,Hes1的表达高。7.阴性对照组大鼠精神可,活动量正常,行动灵活,饮水进食量正常,反应速度正常;阳性对照组大鼠精神较差,活动量明显减少,反应缓慢,饮水进食显著减少,有烦躁、攻击行为。姜黄素治疗组大鼠2-3天后一般情况好转,7-8天恢复正常。8.Morris水迷宫试验,在学习能力测试中,姜黄素治疗组的逃避潜伏时间较阳性对照组显著缩短,错误次数明显减少（p<0.05）。在记忆能力测试中,姜黄素治疗组的原平台象限停留时间比阳性对照组长（p<0.05）,总路径缩短（p<0.05）。9.跳台逃避实验,在学习能力的测试中,姜黄素治疗组的逃避潜伏期比阳性对照组明显缩短,错误次数明显减少（p<0.05）。在记忆能力测试中,姜黄素治疗与阳性对照组相比,潜伏时间明显延长（p<0.05）,错误次数明显减少（p<0.05）。10.血脑屏障通透性检测,姜黄素治疗组较阳性对照组EB含量低（p<0.05）。11.HE染色,阴性对照组:神经细胞无水肿、变形,细胞核大,圆形,细胞排列整齐,边缘规整,细胞界限清楚;阳性对照组:细胞水肿明显,坏死,细胞核固缩、碎裂、溶解;姜黄素治疗组:细胞受损较阳性对照组明显轻。12.GFAP免疫组化染色:大脑海马区星形胶质细胞染成棕褐色者为阳性细胞,密度高,胞体饱满,轮廓较清晰,突起较粗,均匀深染,与阳性对照组相比,姜黄素治疗组与阴性对照组阳性细胞数目少,有显著差异（p<0.05）。13.CNPase免疫组化染色:细胞呈黄褐色,圆形或卵圆形,细胞集中,界线不清,主要分布于胼胝体、扣带回、海马槽、室床、内囊、外囊、脚内核、纹状体、丘脑等,海马结构内呈丝状。与阳性对照组相比,姜黄素治疗组与阴性对照组CNPase阳性灰度值明显升高（p<0.05）。结论1.DAPT能够抑制C17.2神经干细胞的生长与增殖,随着浓度的升高,抑制作用也越强。2.射线能够抑制神经干细胞的生长与增殖。3.姜黄素能够抑制DAPT及射线对神经干细胞的损伤,这种保护作用可能是通过Notch信号通路的作用,影响信号通路下游蛋白的表达而实现的。4.姜黄素可以增加模型鼠在Morris水迷宫试验和跳台回避试验中的学习记忆能力。5.姜黄素可以减轻RIB大鼠血脑屏障破坏程度。6.姜黄素可使GFAP表达减少。7.姜黄素可使CNPase表达增加。