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白藜芦醇属于多酚类物质,是葡萄酒中的一种重要的活性成分。白藜芦醇具有有抗肿瘤、抗心血管疾病和调节免疫等生理作用。白藜芦醇对多种类型肿瘤细胞具有抑制作用,其机理与促使肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤细胞的转移等有关,但其分子机理尚不很清楚,特别是白藜芦醇抑制肿瘤转移的分子机理尚不清楚,本论文以结直肠癌细胞HCT116为研究对象,从肿瘤细胞的运动能力的角度,评估白藜芦醇是否能抑制肿瘤细胞的转移能力,分析其对结直肠细胞HCT116侵袭能力的影响,在此基础上,对白藜芦醇抑制结直肠癌细胞运动能力的分子机理进行了初步分析。白藜芦醇对结直肠癌细胞增殖具有抑制作用。本课题首先采用MTS细胞存活实验分析了白藜芦醇对结直肠癌细胞HCT116增殖的影响。0μmol/L.6.25 pmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150 pmol/L浓度白藜芦醇分别作用12 h、24 h、48 h后,结果发现12h以内0-50μmol/LL,白藜芦醇对HCT116的增殖活动抑制效果不明显。白藜芦醇对结直肠癌细胞的细胞周期具有抑制作用。选用0μmol/L、6.25 μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50 μmol/L、100μmol/L浓度白藜芦醇,处理12h后,通过流式细胞技术分析,结果发现：超过100μmol/L白藜芦醇对结直肠癌细胞周期具有明显的阻滞作用(cell cycle arrest),但在低浓度下0-50 μmol/L范围条件下,对HCT116的影响不明显。综合以上实验结果认为12 h,0-50 μmol/L条件下增殖能力的变化对运动能力的研究无明显的影响。白藜芦醇能促使结直肠癌细胞凋亡。荧光染色实验观察白藜芦醇对结直肠癌凋亡过程的影响,选取0μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、 100 μmol/L、150μmol/L分别作用0 h、12 h、24 h、48 h后选取视野拍照。实验结果表明,在剂量低于50μmol/L、24 h内,HCT116细胞形态完整,细胞核饱满,颜色均匀,无核浓缩及凋亡小体出现,在此条件下白藜芦醇引起的凋亡现象不显著；据此由流式细胞术测凋亡进一步得出以下结论：12 h,0-50μmol/L细胞较少发生凋亡,近少数细胞发生早期凋亡,确定了低浓度0-50μmol/L白藜芦醇引起的凋亡不明显。肿瘤转移是导致患者死亡的最终原因,肿瘤转移是一个非常复杂的过程。癌细胞的运动能力是决定肿瘤转移的一个重要环节。本课题采用癌细胞的迁移能力和侵袭能力两个主要的指标作为判定细胞运动能力的变化,评估白藜芦醇对结直肠癌细胞HCT116运动能力的影响。结果发现：在划痕实验中,50μmol/L处理组划痕宽度最大,25μmol/L和12.5μmol/L次之,6.25 μmol/L组较0 μmol/L组无肉眼可见差异,白藜芦醇处理能使结直肠癌细胞的迁移能力变弱,且呈剂量依赖型。在Transwell实验中,与Control组相比,不同剂量白藜芦醇处理后,HCT116细胞侵袭到小室另外一边的数量明显减少,且白藜芦醇浓度越大,能够侵袭到小室另外一边的HCT116细胞数量越少。将被染色的细胞洗脱下来后测其OD值变化,发现与显微镜下的计数结果一致。以上实验结果提示,白藜芦醇处理能下调结直肠癌细胞HCT116的运动能力。癌细胞的高运动能力与多种基因表达异常相关,癌细胞CD44高表达与细胞黏附和细胞迁移密切相关。为探索白藜芦醇下调结直肠癌细胞运动能力的分子机理,本课题评估了白藜芦醇处理对结直肠癌细胞CD44表达的影响。在白藜芦醇处理12h后,通过实时定量PCR(RT-qPCR)分析,发现白藜芦醇能显著抑制结直肠癌细胞HCT116的CD44 mRNA表达水平,最高下调至对照组的0.3倍,且呈剂量依赖性。进一步通过Western blot分析,发现白藜芦醇亦能显著抑制结直肠癌细胞HCT116的CD44蛋白表达水平,与RT-qPCR分析的结果一致。通过对CD44基因转录水平和翻译水平表达水平分析,证实了白藜芦醇能抑制结直肠癌细胞CD44的表达。CD44表达的调控与AP-1、NF-κB、SP1等多种转录因子活化相关,在CD44基因启动子区域存在转录因子AP-1、NF-κB、SP1的结合位点。为探讨白藜芦醇能抑制结直肠癌细胞CD44表达的信号通路,课题分析了白藜芦醇对转录因子活性的影响。带有荧火虫荧光酶的AP-1、NF-κB报告基因(reporter gene)转染到结直肠癌细胞HCT116,白藜芦醇处理后,发现其能同时抑制AP-1、NF-κB的反式激活活性,提示白藜芦醇可能通过抑制AP-1、NF-κB活性介导CD44表达下调。基于以上实验研究,本课确定了白藜芦醇能抑制结直肠癌细胞的运动能力,并分析了其作用的分子机理：白藜芦醇处理→AP-1、NF-κB活性↓→CD44表达↓→癌细胞运动能力↓。