目的该研究旨在探究在胃癌细胞中靶向调控KLF2的miRNAs以及明确胃癌中KLF2调控PTEN的分子机制,为探索胃癌生物标志物和靶向药物开发奠定基础。方法(1)构建胃癌细胞KLF2过表达和敲除稳定转染株;(2)采用生物信息学软件Targetscan预测可结合KLF2的miRNAs,筛选最优miRNA,然后使用双荧光素酶报告基因体系验证miRNA对KLF2的作用;体外细胞功能实验进一步证实miRNA在细胞水平上对KLF2的调控作用及二者对胃癌细胞增殖和迁移的影响;(3)Targetscan软件预测PTEN启动子中的KLF2结合位点;双荧光素酶报告基因体系验证KLF2是否结合PTEN启动子;Western blot验证KLF2对PTEN及PI3K/AKT信号通路的影响;(4)胃癌细胞中共转染miRNA32-5p和shKLF2后,Western blot检测PTEN和PI3K/AKT通路相关蛋白的表达。结果(1)我们成功构建了 KLF2过表达和敲除稳定转染细胞株。MTS细胞增殖实验、细胞迁移实验和克隆形成实验结果表明KLF2敲除显著促进了 MKN45细胞的增殖和迁移,而在KLF2过表达的MGC803细胞中结果则相反。(2)首先通过生物信息学软件Targetscan预测并实验筛选得到miRNA-32-5p作为后续研究对象。TCGA数据库分析显示miRNA-32-5p在胃癌中表达显著增加。随后,荧光素酶报告基因体系分析结果表明,与突变组相比,野生组转染miRNA-32-5p mimics后荧光活性明显降低,Western blot实验结果也表明miRNA-32-5p可抑制KLF2蛋白表达。此外,体外细胞功能实验结果显示miRNA-32-5p可促进胃癌细胞的增殖和迁移,且与KLF2敲除对促进胃癌细胞的增殖和迁移具有协同作用。(3)软件Targetscan预测得到PTEN启动子中KLF2的三个结合位点,并构建PTEN野生型和突变质粒,转染MKN45细胞后进行荧光检测。结果显示野生组细胞的荧光活性显著低于对照组和突变组的荧光活性。Western blot结果表明KLF2敲除以及转染miRNA-32-5p mimics后PTEN的表达均下调,而细胞中AKT,mTOR和p70S6K的磷酸化水平升高。结论综上,我们的实验证实KLF2直接结合PTEN启动子,在转录水平影响了PTEN表达,并首次提出了 KLF2作用于PTEN启动子的结合位点序列。另外,筛选出的miRNA-32-5p也被证实可通过靶向KLF2和PTEN参与胃癌的发生发展,这一结果丰富了胃癌发生和转移分子机制的理论基础,而这些基础工作对胃癌临床诊断和治疗具有比较重要的意义。图15表10参66