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丝黑穗病可以给农业生产造成巨大的损失,是世界性的重要高粱病害,也是影响我国高粱生产总量的主要病害之一。应用抗病品种是防治高粱丝黑穗病最有效的途径之一,而应用分子标记方法找到抗丝黑穗病基因是选育抗病品种并在生产上应用的重要保证。本实验采用分子标记PAPD 及SSR 技术,利用恢复系分离群体(2381R/矮四),筛选抗丝黑穗病3 号生理小种基因的分子标记,实现实验室内对抗丝黑穗病的选择,为生产上利用分子标记辅助选择选育抗病品种提供基础。
主要研究结果如下:
1.利用RAPD分子标记技术进行多态性分析时,采用25 μl 反应体系:10×Buffer 2.5 μl,25mmol/L MgCl2 2.5 μl,40mmol/L dNTPs 0.5 μl,5U/μl Taq 酶0.5 μl,2 μmol/L 引物1.0 μl,DNA 模版100ng,ddwatwe 补足25 μl,进行扩增反应。扩增产物用1.4[%]琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明:从400 条引物中扩增出条带清晰、重复性好的引物有128 条,扩增率为32[%],其中76 条引物为多态引物,各引物扩增的带数平均在3~9 条之间。抗、感亲与抗、感池之间差异不一致,表明所筛选的RAPD 引物与高粱抗丝黑穗病3 号生理小种基因之间不连锁。
2.利用SSR分子标记技术进行多态性分析时,优化了20 μl 反应体系:1U/μl TaqE 2.5 μl,10mmol/L dNTPs1.5 μl,25mmol/L MgCl2 1.5 μl,DNA 模板100ng,2 μmol/L 引物1.5 μl,10×Buffer 2.0 μl。利用两种PAGE 凝胶电泳方法:变性、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,两种染色方法:硝酸银染色、银氨染色。结果表明:从150 对引物中筛选出102 对引物有扩增产物,且条带清晰、稳定,扩增率为68[%],有1 对引物IS10 264在抗、感亲与抗、感池之间差异一致。引物IS10 264 位于I 染色体上,用引物IS10 264 对F2 代群体的114 株抗病个体和60 株感病个体DNA 进行扩增,得到引物IS10 264与抗病基因的重组率为9.8[%],相对遗传距离为9.8cM。