绿原酸对金属蛋白酶致大菱鲆肝细胞氧化损伤保护作用研究

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为了证实绿原酸对金属蛋白酶诱导大菱鲆(Scophthalmus maximus)肝细胞损伤中保护作用,本试验首次克隆和分析了Nrf2和β-actin基因,检测Nrf2在不同组织中的表达。同时,在体外条件下,将金属蛋白酶低浓度组(2μg/ml)、中浓度组(10μg/ml)和高浓度组(50μg/ml)作用于大菱鲆肝细胞2h、4h、8h和16h。通过酶活测定、RT-qPCR及流式细胞等技术,首先通过测定SOD、CAT活力MDA含量及Nrf2和HO-1基因的相对表达水平,同时测定肝细胞活性氧(ROS)和凋亡情况,获得了金属蛋白酶致大菱鲆肝细胞氧化损伤的程度;进一步研究了绿原酸(9μg/ml、18μg/ml和36μg/ml)对金属蛋白酶胁迫肝细胞后上述的抗氧化指标及基因的相对表达情况,明确了绿原酸对金属蛋白酶致大菱鲆肝细胞氧化损伤的保护作用。大菱鲆Nrf2基因cDNA全长2448bp,开放阅读框(ORF)为1983bp,编码660个氨基酸,5′-非编码区(UTR)为44bp,3′-UTR为421bp。大菱鲆Nrf2基因与高体鰤(Seriola dumerili)的同源性最高为83.5%,与鸡(Gallus gallus)的同源性最低为43.2%。系统进化分析表明,大菱鲆Nrf2基因与高体鰤的亲缘关系最近。RT-qPCR检测结果表明,Nrf2在检测的8个组织中均有表达,其中在肝组织中表达量最高,胃中表达量最低;大菱鲆β-actin基因cDNA全长为1930bp,ORF为1128bp,编码375个氨基酸,5′-UTR为104bp,3′-UTR为698bp。大菱鲆β-actin基因与松江鲈(Trachidermus fasciatus)和点带石斑鱼(Epinephe lus coioides)的同源性最高为100%,与小鼠(Mus musculus)和鸡(G.gallus)的同源性最低,为96.9%。系统进化分析表明,β-actin基因与红鲷鱼(Pagrus auratus)的关系最近,与鸡(G.gallus)和哺乳动物亲缘关系最远。通过生化法和RT-qPCR技术分别测定肝细胞中SOD和CAT活性、MDA含量及其抗氧化基因Nrf2和HO-1的mRNA表达水平。试验结果表明,各浓度金属蛋白酶胁迫肝细胞后,SOD活力除2h低、中浓度与对照组无显著差异外(P>0.05),其他时间点各浓度组均显著低于对照组(P<0.05);各浓度组作用肝细胞2-16h CAT活力均显著低于对照组(P<0.05);MDA含量除2h低、高浓度组与对照组无显著外(P>0.05),其他时间点各浓度组均显著高于对照组(P<0.05);与对照组相比,Nrf2基因表达量除2h各浓度组和4h低浓度无显著性(P>0.05)外,其他时间点各浓度组均显著高于对照组(P<0.05);HO-1基因的相对表达水平除2h低浓度组和16h高浓度组不显著外,其他时间点均显著高于对照组(P<0.05);利用流式细胞仪检测了不同浓度金属蛋白酶处理肝细胞4h后细胞内ROS和凋亡率的影响,结果表明,与对照组相比,各金属蛋白酶浓度组胁迫肝细胞后,ROS含量显著升高,细胞凋亡率显著增加。基于上述试验结果,本研究通过测定抗氧化酶SOD和CAT活性、MDA含量及其抗氧化基因Nrf2和HO-1的mRNA表达水平,进一步明确了不同浓度绿原酸对50μg/ml金属蛋白酶诱导大菱鲆肝细胞4h的氧化损伤保护作用。试验结果显示,与对照组相比,金属蛋白酶处理组胁迫肝细胞4h后,肝细胞中SOD和CAT活力显著下降(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05),Nrf2和HO-1基因的表达水平显著升高(P<0.05),而不同浓度绿原酸预处理组SOD和CAT活力显著高于金属蛋白酶组(P<0.05),MDA含量显著低于金属蛋白酶组(P<0.05)。36μg/ml绿原酸预处理组的肝细胞Nrf2基因的表达量显著高于金属蛋白酶组(P<0.05);而18μg/ml和36μg/ml绿原酸预处理组的肝细胞HO-1基因的表达量显著高于金属蛋白酶组(P<0.05)。综上所述,金属蛋白酶可以诱导肝细胞产生氧化应激,表现为抗氧化酶SOD和CAT活性降低,MDA含量增加以及Nrf2和HO-1表达量升高,同时细胞ROS含量升高,细胞凋亡率增加;增加绿原酸可以提高肝细胞的抗氧化能力,降低脂质过氧化物MDA的含量,并进一步上调Nrf2和HO-1基因的表达。
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