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研究目的:将不同比例的ATDC5细胞与已被腺病毒转染的软骨细胞构建共培养体系,软骨细胞为ATDC5提供TGF-β3,评估这个共培养体系对于促进ATDC5细胞向软骨分化的影响,为其将来应用于软骨的修复提供实验基础。方法:一、细胞收集、培养原代软骨细胞需从新鲜猪软骨中提取,然后经体外培养传至第三代后冻存备用。ATDC5细胞购自美国Abgent公司,用ATDC5培养基在150cm2培养瓶中培养。HEK-293细胞购自American type culture collection（ATCC）,用HEK-293培养基在75cm2培养瓶中培养。二、扩增腺病毒、提纯及测定滴度在之前的研究中已构建好了Ad-T,将其转染HEK-293细胞进行扩增,然后进行提纯及测定滴度。三、构建海藻酸盐水凝胶三维共培养体系将腺病毒转染P4软骨细胞,然后按1:1及3:1的比例将ATDC5和软骨细胞混合（分别为命名为1A1C及3A1C）。另外再建立两对照组（A组）,均以单独的ATDC5细胞构成,其中一对照组在培养基中加入外源性的TGF-β3（ArT组）。上述4组细胞收集后在海藻酸盐溶液中重悬,制成细胞/海藻酸盐混合物,然后将这些细胞混合液滴入CaCl2溶液,海藻酸盐与钙离子交联后形成水凝胶微球,收集微球转移至24孔板,以软骨诱导液为培养基进行培养。四、检测两实验组培养基中TGF-β3浓度、各组细胞增殖活性及成软骨情况。培养期间收集两实验组的培养基用于检测TGF-β3的释放情况。在确定的时间点收集相应的标本,检测细胞增殖活性,培养结束后检测软骨标志性基因的表达情况,再通过组织学染色、免疫组织化学染色以及Western Blot等方法检测相关蛋白的表达情况,从而分析共培养组与对照组之间的差异。结果:一、顺利地从新鲜猪软骨中提取软骨细胞然后扩增,传至第三代冻存备用,将ATDC5及HEK-293扩增至足够数量后冻存于液氮罐中备用。这个过程中观察到原代软骨细胞生长效慢,呈多角形,扩增到第三代后细胞变大,生长速度加快;ATDC5细胞较小,呈圆形,贴壁生长,生长迅速;HEK-293呈圆形或椭圆形,轻度贴壁生长,生长速度快。二、用携带TGF-β3基因的重组腺病毒成功转染HEK-293细胞,并将病毒扩增、提纯及测定滴度,最终扩增病毒所得的滴度为4.38×109（ifu/ml）。三、两实验组的培养基中均能检测出TGF-β3,都是第三天达到高峰,第6天迅速下降,此后维持在一个较低的水平。3A1C组的细胞增殖活性最高,为实验开始时的3.5倍,而两对照组的细胞增殖活性变化不大。两实验组软骨标志性基因（Ⅱ型胶原蛋白及ACAN）的表达水平高于P4软骨细胞,与猪软骨的相当。组织学检查方面,HE染色可见两实验组细胞生长密集,两对照组细胞稀疏,特别是A组。番红染色中两实验组的切片见细胞周围大量红染区,而对照组的红染区少。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示两实验组切片见有大量棕褐色区域,而两对照组很少（ArT）甚至缺如（A）。证实本研究构建的三维共培养体系能够更好地促进ATDC5的成软骨分化。结论:本研究构建的TGF-β3控释系统能够高效地促进ATDC5成软骨分化,而且减少软骨细胞的情况下,促进软骨分化的作用不受影响。后续的研究可以进一步优化这个系统,比如采用更稳定的慢病毒作为基因载体,进一步优化共培养中的细胞的比例,以更好地调节TGF-β3产生的量及持续时间,这样可以为种子细胞的定向软骨分化提供更好的微环境,为软骨修复提供新的解决方案。