肠道沙门氏菌是一类重要的人畜共患革兰氏阴性致病菌,通常以入侵型的非伤寒或伤寒疾病形式给全球带来巨大的健康与经济负担。在大部分情况下,非伤寒类疾病的主要诱因是S.Typhimurium或者S.Enteritidis感染,而伤寒类疾病的主要诱因则是S.Typhi或者S.Paratyphi A感染。在本论文研究中,我们试图构建新型的S.Typhimurium重组减毒活疫苗,使之作为疫苗载体,可同时递呈多种同源或异源型保护性抗原,从而获得更为广谱的交叉免疫保护效果,主要研究结果如下:一、S.Typhimurium O抗原的可逆表达与外膜蛋白交叉免疫原性的增强在本章研究中,首先通过LPS银染实验,证实了cps基因簇中的cps G基因与rfb基因簇中的rfb K基因实为同工酶基因。缺失了这两个基因后,S.Typhimurium便无法正常合成O抗原多聚糖链,然而,在体外培养时,额外添加mannose单糖,可恢复其O抗原合成的能力,由此通过mannose单糖的添加与否便可实现O抗原的可逆表达。为了评价完全阻断Colanic acid及O抗原多糖的合成是否有助于增强其外膜蛋白的交叉免疫原性,我们将Δrfb KΔcps G双缺失引入到S.Typhimurium S738（ΔcrpΔcya）减毒活疫苗株中。结果显示,与亲本株相比,新构建的减毒活疫苗能显著刺激小鼠机体产生更高的anti-S.Typhimurium,anti-S.Enteritidis及anti-S.Choleraesuis OMP等Ig G抗体水平。免疫后的小鼠均可有效抵御S.Typhimurium野生强毒株的攻毒,也可部分抵御异源型S.Choleraesuis和S.Enteritidis的野生强毒株攻毒。结果表明,Δcps GΔrfb K的双缺失,可以增强沙门氏菌减毒活疫苗的交叉免疫保护作用。二、异源表达S.Enteritidis（O9）,S.Newport（O7）及S.Choleraesuis（O8）O抗原血清型的新型S.Typhimurium减毒活疫苗构建策略在本章研究中,通过基因重组技术,成功将S.Typhimurium的主血清型O4分别转换为了S.Enteritidis的主血清型O9,S.Choleraesuis的主血清型O7以及S.Newport的主血清型O8。随后,基于O抗原血清型转换策略而构建的新型减毒活疫苗均能诱导小鼠机体产生大量的针对相应异源型O抗原结构的Ig G抗体。此外,细菌外膜表面C3补体沉积率及巨噬细胞吞噬率实验均证明这类Ig G抗体具有相应的生物活性。经减毒活疫苗免疫后的小鼠都可以抵御100倍LD50的S.Typhimurium野生强毒株的攻毒,而对异源野生型强毒株的保护则有明显的O抗原结构相关性。此外,经O9和O7 O抗原血清型转换后的减毒活疫苗联合免疫后的小鼠,具有更为广谱的可同时抵御S.Typhimurium,S.Enteritidis和S.Choleraesuis野生强毒株攻毒的能力。结果表明,通过遗传学的手段,可以成功对S.Typhimurium外膜O抗原的结构进行改造,以此开发出的新型减毒活疫苗可预防其它几种最主要的非伤寒类沙门氏菌感染。三、异源表达S.Typhi O9 O抗原血清型及Vi荚膜多糖的新型S.Typhimurium减毒活疫苗构建策略在本章研究中,通过基因重组的技术,成功构建了Vi夹膜多糖可体内诱导表达而O9 O抗原血清型能持续稳定表达的新型S.Typhimurium减毒活疫苗。此减毒活疫苗能很好地刺激小鼠同时产生anti-Vi及anti-O9的特异性免疫反应,且重组表达于S.Typhimurium外膜表面的Vi夹膜多糖并不会减弱机体对O9 O抗原的免疫识别。体外血清杀菌实验证实,较高水平的anti-Vi和anti-O9抗体能有效裂解S.Typhi或其它表达有Vi夹膜多糖或O9 O抗原血清型的沙门氏菌,并能有效保护小鼠抵御强毒性的野生型S.Typhimurium和S.Enteritidis的攻毒。结果表明,改造后的S.Typhimurium减毒活疫苗能很好地建立针对Vi夹膜多糖及O9 O抗原这两类抗原的特异性免疫反应,从而有效地克服了S.Typhi感染初期的固有免疫逃避作用。四、异源表达S.Paratyphi A O2 O抗原血清型的新型S.Typhimurium减毒活疫苗构建策略在本章研究中,通过基因重组的技术,成功将S.Typhimurium的O抗原主血清型转换为了S.Paratyphi A的O2 O抗原主血清型。研究发现,在O抗原的合成代谢中,S.Typhimurium并不能很好地利用O2 O单元底物来合成O2 O抗原多聚糖链,而这种排斥效应可通过将S.Typhimurium O抗原基因簇中的abe、wzx B1及wba VB1基因分别替换为S.Paratyphi A的prt-tyv A1、wzx A1及wba VA1基因得以缓解。由此,我们构建了一系列旨在降低S.Typhimurium O2 O单元底物排斥效应,并合理平衡其外膜表面O2及O4 O抗原免疫位点的新型减毒活疫苗。结果显示,新构建的减毒活疫苗能刺激小鼠机体产生较高水平的anti-S.Paratyphi A或者anti-S.Typhimurium O抗原结构的Ig G特异性抗体。并且,体外C3补体膜表面沉积率实验及巨噬细胞吞噬率实验证明了这类特异性抗体都具有相应的生物杀菌活性。结果表明,基于重组及调控表达O2 O抗原血清型的S.Typhimurium减毒活疫苗可以有效地预防S.Typhimurium与S.Paratyphi A的混合感染。综上,本论文的主要研究结果在于突破了传统减毒活疫苗“一苗单价”的限制,通过重塑或重排S.Typhimurium外膜表面的重要保护性抗原,构建了一系列新型的S.Typhimurium重组减毒活疫苗,使之经单独免疫或联合免疫后,可同时预防最主要的几类非伤寒类沙门氏菌的感染,如S.Typhimurium、S.Enteritidis、S.Choleraesuis及S.Newport,亦可有效预防最主要的伤寒类沙门氏菌的感染,如S.Typhi及S.Paratyphi A。本论文的结果将进一步推动细菌减毒活疫苗的基础性研发工作,并为交叉免疫减毒活疫苗的设计提供可参照的策略。