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目的:萜类化合物(Terpenoids)为主要存在于植物的根、茎、花、叶、花、果实中的天然产物。三萜及三萜皂苷是由6个异戊二烯单元组成的萜类化合物,化学结构复杂,药理活性多样。乌索烷型三萜皂苷是由α-香树脂醇(α-amyrin)衍生而来的五环三萜类化合物。多种乌索烷型三萜,如熊果酸、18-去氢乌索酸等,具有抗菌消炎、抗血栓、保肝等生物学活性,有着较高的药物开发价值。可大多数植物所含的三萜及三萜皂苷组成成分复杂,含量不均,分离提纯提取困难,严重限制了它们的开发与利用。近年来,随着合成生物学的发展,异源生物合成使得大量获得有药用价值的天然活性成分成为了可能。因此,本论文根据合成生物学的原理,以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WAT11为宿主,并结合酵母内源萜类合成通路相关关键酶基因的调控,构建高产α-amyrin的酵母菌株,为后期构建完整的三萜皂苷合成通路,并实现在酿酒酵母中持续、大量生产熊果酸、18-去氢乌索酸等乌索烷型三萜化合物奠定基础。方法:1.WAT11基因编辑靶点分析通过查阅文献,明确本实验室保存的酿酒酵母菌种WAT11的营养缺陷型。在NCBI上搜索各个缺陷基因在酿酒酵母S288c染色体的分布位置,提取基因组,PCR扩增各缺陷基因,测序,分析基因序列,了解WAT11营养缺陷基因的失活方式以及各个基因编码区的上下游序列,以营养缺陷基因位点作为基因编辑靶点。2.WAT11基因编辑根据靶位点的实际序列,用在线软件CHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no)设计gRNA序列,以带有trp1-gRNA序列的pRS42H-trp质粒为模板,用反向PCR(Inverse PCR,iPCR)方法扩增出含有目标靶位点gRNA序列的线性化片段,经T4连接酶环化后,构建各个靶位点的特定gRNA质粒。分别以酿酒酵母WAT11、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的基因组为模板,扩增MVA途径的关键基因,插入p426-GPD载体。设计带有相应靶位点同源臂的引物,扩增包含目的基因表达盒的供体片段,用CRISPR/Cas9技术实现目的基因的基因组整合或靶点的基因敲除,获得WAT11衍生菌株。3.WAT11衍生菌株代谢产物分析以相同条件培养WAT11衍生菌株,以角鲨烯为标示化合物评价衍生菌株的产量。用GC/MS测定三萜的共同中间体角鲨烯(经氧化、环合后可生成α-amyrin)含量,以WAT11为参照,筛选出角鲨烯产率最高的衍生菌株。进一步,将课题组前期构建的香树脂醇合酶基因IaAS1基因的表达质粒pEXPR-IaAS1转入该衍生菌株,获得带游离质粒的酵母菌株,与此同时用CRISPR/Cas9的技术构建将IaAS1基因表达盒整合进基因组的酵母菌株,比较带游离质粒菌株与整合基因组菌株的α-amyrin的产量,筛选出α-amyrin积累量较高的目标菌株。结果:1.确定了对WAT11基因编辑的靶点由文献可知,WAT11为trp1、ade2、can1、ura3、his3、leu2营养缺陷型菌株,且基因序列连续,不具内含子。此外,WAT11A萜类合成通路中二萜分支通路编码GGPPS的BTS1基因完整连续。故选定LEU2、TRP1、CAN1、URA3、ADE2、HIS3、BTS1这7个靶点作为基因编辑位点,进行后续实验。2.构建了10种WAT11衍生菌株针对萜类合成通路中tHMGR(记为t)、FPPS(f)、SS(s)、IPPI1(i1)、IPPI2(i2)、ACS(A),成功构建了WAT11t、WAT11f、WAT11s、WAT11i1、WAT11i2、WAT11ts、WAT11ti1、WAT11tf、WAT11tfA这9株基因敲入菌株,还构建了1株敲除二萜通路途径BTS1(g)基因的菌株WAT11Δg。在相同条件下培养72h,比较这10株酿酒酵母的角鲨烯产量,发现WAT11tfA菌株的角鲨烯产量比WAT11提高了近20倍。3.获得了高产α-amyrin的酿酒酵母工程菌将pEXPR-IaAS1表达质粒转入上述获得的WAT11tfA细胞,构建WAT11tfA/IaAS1菌株;用CRISPR/Cas9技术将IaAS1基因表达盒整合进WAT11tfA基因组的HIS3位点上,构建WAT11tfAX菌株。分别用SC-U/Gal和YPD培养基培养3 d,比较了2株菌株积累α-amyrin的情况。结果证明,与WAT11/IaAS1比较,WAT11tfA/IaAS1和WAT11tfAX菌株的α-amyrin产率均明显提高,WAT11tfA/IaAS1菌株的α-amyrin产量为4.67±0.21 mg/L,约是WAT11的21倍,WAT11tfAX菌株的α-amyrin产量为2.18±0.14mg/L,约是WAT11的10倍,WAT11tfA/IaAS1的产量略高于WAT11tfAX。为了进一步考察各菌株α-amyrin的积累情况,对WAT11tfA/IaAS1和WAT11tfAX菌株以相同的培养条件培养7 d,WAT11tfA/IaAS1菌株的α-amyrin产量为13.26 mg/L,角鲨烯的积累量为105.47mg/L;而WAT11tfAX菌株的α-amyrin产量为10.39 mg/L,角鲨烯的积累量可达210.20 mg/L。结论:本论文针对萜类合成通路的MVA途径,通过CRISPR/Cas9技术改造萜类合成途径,构建了1株高产角鲨烯的菌株WAT11tfA和2株高产α-amyrin的WAT11tfA/IaAS1和WAT11tfAX。这些菌株的构建不仅使得熊果酸、18-去氢乌索酸等乌索烷型三萜的微生物大量生产成为可能,而且也为其它构型的三萜化合物相关研究奠定了基础,显示了合成生物学在药用植物活性成分的微生物生产方面的巨大潜力。