【摘 要】
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对羟基苯甲酸甲酯（MP）属于芳香族化合物,作为抗菌剂、防腐剂以及饲料添加剂在工业市场上有较大需求,在制备生物基聚醚酯材料方面也具有潜在应用价值。以合成生物学为手段,开发一种环境友好的MP合成方法具有重要意义。酿酒酵母作为典型的真核细胞模式菌,为合成芳香族化合物及其衍生物提供了广阔的平台。本文以酿酒酵母BY4741为底盘细胞,将来源于大肠杆菌的编码分支酸裂合酶基因Ubic与来源于澳大利亚烟草的编码苯
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对羟基苯甲酸甲酯（MP）属于芳香族化合物,作为抗菌剂、防腐剂以及饲料添加剂在工业市场上有较大需求,在制备生物基聚醚酯材料方面也具有潜在应用价值。以合成生物学为手段,开发一种环境友好的MP合成方法具有重要意义。酿酒酵母作为典型的真核细胞模式菌,为合成芳香族化合物及其衍生物提供了广阔的平台。本文以酿酒酵母BY4741为底盘细胞,将来源于大肠杆菌的编码分支酸裂合酶基因Ubic与来源于澳大利亚烟草的编码苯甲酸羧甲基转移酶基因Bsmt-1导入酿酒酵母细胞中,实现MP的生物合成途径。本研究通过多种代谢工程策略以提升MP的生物合成产量。首先,对宿主细胞的中心碳代谢途径进行了改造,增强中枢代谢通量:（1）通过对莽草酸途径的关键酶基因的过表达和竞争途径的敲除来加强莽草酸途径的碳通量;（2）通过将丙酮酸激酶基因替换为较弱启动子以及敲除编码丙酮酸脱羧酶的基因PDC5,增加磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）进入莽草酸通量;（3）引入来源于短双歧杆菌的磷酸酮醇酶,使果糖-6-磷酸快速、高效合成4-磷酸-赤藓糖（E4P）,以此增加E4P含量。经过上述优化后的菌株所得MP含量为41.91 mg/L。其次,在增强前体供应水平基础上,探讨了多种策略及调控机制来提高苯甲酸羧甲基转移酶活性:（1）将丙酮酸裂合酶与苯甲酸羧甲基转移酶的启动子分别替换为不同强度的组成型启动子,以获得最高效的启动子驱动组合;（2）将分支酸裂解酶与苯甲酸羧甲基转移酶设计为融合蛋白,增加苯甲酸羧甲基转移酶表达量;（3）对调控莽草酸途径的MYB型转录因子-EOBI进行过表达。对比这三种策略,改造后菌株合成MP可达到51.78 mg/L。最后,对发酵培养基的组成与含量进行单因素变化实验,综合碳源、氮源、碳氮比设计正交试验进行优化,并组合多种代谢工程策略所得最优菌株生产MP达到68.59 mg/L。这也是目前利用酿酒酵母生物合成MP的最高产量,所改造后的最优菌株也为其他芳香族化合物提供了生产平台。
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