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新城疫(Newcastle disease,ND)是禽类高度传染性病毒性疾病,在全世界性范围内呈地方性流行。ND的病原体是新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)。NDV只有一个血清型,但具有众多基因型。目前广泛应用的NDV La sota疫苗为基因II型,而我国目前主要流行强毒株为基因Ⅷ型NDV。现有疫苗虽然能够对基因Ⅷ型NDV强毒株感染提供临床保护,但不能有效的阻止其在鸡体内的复制和排毒,导致免疫鸡群疫病的发生。因此,迫切需要研制针对基因Ⅷ型NDV强毒株的新型NDV疫苗。Fusion(F)蛋白是NDV的囊膜糖蛋白,也是NDV的主要保护性抗原,可插入病毒载体中作为活病毒载体疫苗进行应用。传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是鸡的急性上呼吸道传染病,病原是传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)。ILT的防制主要依靠严格的生物安全措施和疫苗免疫,商品化致弱活疫苗和表达ILTV抗原的病毒载体疫苗是目前控制ILT的主要疫苗,但存在毒力返强和保护效果不完全的缺陷。为了克服现有疫苗的不足,科研人员尝试研发ILTV基因缺失疫苗和ILTV活载体疫苗。此外,ILT活疫苗可以通过气雾或饮水的方式大规模应用,因此ILTV可作为表达其他病原免疫保护性抗原的载体。在本研究中,分离并鉴定了一株ILTV,命名为ck/CH/LHLJ/120305(LHLJ/120305)。该毒株感染SPF鸡只不引起任何呼吸道症状,气管致病指数(Intratracheal pathogenicity index,ITPI)值为0,在感染鸡的气管和喉头未观察到明显的病理变化。LHLJ/120305在喉头和气管内的复制和排毒检测结果显示LHLJ/120305株在喉头和气管中可以复制但它在组织中的病毒DNA载量明显低于ILTV强毒WG株。以上结果证明LHLJ/120305株是一株ILTV弱毒株。LHLJ/120305可以为SPF鸡提供针对ILTV WG株的完全保护,并且没有检测到排毒,这些结果说明LHLJ/120305可以作为ILT的疫苗候选毒株。为探索LHLJ/120305株是否可作为病毒载体,以LHLJ/120305作为亲本毒,采用同源重组技术,将病毒的US9基因编码区缺失后引入绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)表达盒,获得了表达GFP的重组传染性喉气管炎病毒ILTV-?US9-G株,并且GFP蛋白能够在ILTV-?US9-G感染的细胞中表达。ILTV-?US9-G的最大病毒滴度与亲本病毒LHLJ/120305株相近,但生长速率略有延迟。这一结果表明ILTV US9基因编码区缺失和GFP表达盒的引入并不影响病毒的体外增殖特性。为了进一步研究外源基因的引入对ILTV病毒的致病性及免疫原性的影响,以ILTV-?US9-G作为亲本病毒,将GFP基因替换为基因Ⅷ型NDV主要保护性抗原F基因,获得了表达NDV F蛋白的重组病毒ILTV-?US9-F株。ILTV-?US9-F和亲本病毒LHLJ/120305的体外复制能力基本一致。将ILTV-?US9-F在LMH上连续传代至15代,通过间接免疫荧光和蛋白质印迹法对每5代的病毒的F蛋白的表达进行了检测,结果显示,不同代次的ILTV-?US9-F均能稳定表达NDV F蛋白。ILTV-?US9-F接种SPF鸡后,鸡只没有出现任何临床症状且未检测到排毒,并与LHLJ/120305一样,用ILTV强毒WG株的攻击免疫鸡后ITPI评分为0且未在咽拭子检测到ILTV。为了评价ILTV-?US9-F对NDV强毒株的免疫保护效果,ILTV-?US9-F免疫后检测了免疫鸡的抗体水平并进行了不同基因型NDV强毒株的攻毒保护试验。与La Sota相比,10~4PFU剂量的ILTV-?US9-F免疫后诱导产生的NDV ELISA抗体和中和抗体的滴度非常低。当用IX型NDV强毒株F48E9株攻击时,La Sota与ILTV-?US9-F均能提供临床保护,且均未检测到排毒,NDV的主要靶器官也未再重新分离到病毒。但当用NDV基因Ⅷ型ck/CH/LHLJ/1/06株攻击时,虽然La Sota与ILTV-?US9-F一样能提供临床保护,但从La Sota组中40%(2/5)鸡体内重新分离到NDV,而ILTV-?US9-F组所有组织中均未分离到NDV。攻毒后4d的排毒情况也表明ILTV-?US9-F(10%)的排毒保护效果好于La Sota(30%)。此外,本研究对ILTV-?US9-F针对NDV的最小免疫剂量进了评价。结果显示,以10~3PFU剂量免疫ILTV-?US9-F后,可以提供针对NDV强毒株ck/CH/LHLJ/1/06株的完全的临床保护,而以10~2PFU剂量免疫后也可以获得95%的临床保护,ILTV-?US9-F的最小免疫剂量可以定为10~3PFU。综上所述,本次试验成功构建了表达基因Ⅷ型NDV F蛋白的重组传染性喉气管炎病毒,该毒株免疫动物可以抵抗新城疫强毒株和传染性喉气管炎强毒株的攻击。ILTV-?US9-F株可以作为NDV和ILTV二联活载体疫苗的候选毒株。