大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)是棉花黄萎病的病原真菌，是导致棉花减产的主要原因，在世界范围内造成严重的经济损失。但是，目前对于黄萎病菌的治病机理并不是十分清楚，大量的研究可以划分为两种观点，一种认为黄萎病菌在植株导管中的大量繁殖生长导致的维管束堵塞，相对应的，认为引起植株出现萎蔫坏死的主要原因是大丽轮枝菌生长过程中产生的一系列毒素。　　 大丽轮枝菌nep基因编码的诱导坏死蛋白(NEP1-1ikeprotein，NLP)是一类存在于微生物中的效应蛋白，许多真菌细菌及卵菌都可以产生诱导坏死蛋白，该类蛋白能够诱导植物病程相关基因表达，产生活性氧和乙烯，发生超敏反应，使宿主细胞程序性死亡。NLPs能够诱导多种双子叶植物产生过敏反应，但是对于单子叶植物没有作用。　　 为了更好的深入了解大丽轮枝菌的致病机理，本论文着手于利用分子生物学手段对大丽轮枝菌基因组中存在的可能对致病性有关的基因进行研究，通过基因敲除的方法对V.dahliae中的nep基因进行敲除，构建敲除突变株，并通过对突变株的一系列生理生化特征的对比，了解该基因对于V.dahliae致病性是否必需，为大丽轮枝菌致病机理的探索提供了一些分子依据。　　 本研究对于大丽轮枝菌nep基因的功能进行了初步的探索和分析，具体工作内容如下:　　 1、采用生物信息学手段，将待研究的大丽轮枝菌基因编码蛋白序列导入NCBI中，Blast获取其他植物病原菌的诱导坏死蛋白序列，通过ClusterX软件序列比对及Pfam数据库保守域分析，发现与其他致病菌一样，氨基酸序列含有NLPs中特有的七肽保守基序“GHRHDWE”，进一步通过系统进化树的构建，发现该基因编码蛋白为TypeⅡNLP蛋白，从而确定了该基因为诱导坏死基因。　　 2、建立了适于大丽轮枝菌的高效基因敲除体系，(1)采用融合PCR的方法，设计两对反向互补引物，只需进行两轮PCR即可得到同源重组融合片段;(2)同源重组载体的转化使用农杆菌介导的大丽轮枝菌的转化方法(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation，ATMT)，能够快捷高效的得到转化子;(3)优化大丽轮枝菌基因敲除转化子筛选体系。　　 3、比较了野生型、基因敲除突变型以及随机插入型的各项生理特征，(1)将培养好的新鲜孢子浓度稀释至107个/ml，吸取3μl点至PDA平板中央，每天测量菌落直径大小发现，基因敲除突变型菌落生长速率较野生型稍有迟缓，(2)将培养好的孢子悬浮液用无菌水调至1×107个/ml，吸取200μl接种于20ml查氏培养基中，25℃、200rpm摇床培养，一周后显微镜下血球细胞板计数，基因敲除突变株的产孢子能力与野生型并没有多大的差异，(3)水培法培育棉苗，用调至1×107个/ml的孢子悬浮液浸泡棉苗根部，观察棉苗病情，发现用突变型与野生型大丽轮枝菌侵染，植株叶片病斑程度及大小相一致，nep基因的敲除并没有影响到大丽轮枝菌对棉花宿主的致病力。