论文部分内容阅读
背景：
早孕因子(Early pregnancy factor，EPF)是一种具有免疫抑制和生长调节活性的妊娠相关蛋白，是目前已明确报道的最早确认妊娠的生化指标[1]。本课题组一直从事EPF研究工作，天然EPF的难获得和分子克隆技术的快速发展，使我们的研究方向愈加倾向于用基因重组的方法制备接近天然构象的重组EPF(Recombinant Early Pregnancy Factor，rEPF)。虽然rEPF的生产较传统提取工艺有明显优势，但由于缺乏EPF分子量、结构、种属来源与抗体识别间关系的研究，目前不能确定来自孕早期血清的人源性EPF和体外重组表达的rEPF诱导的抗体是否具有交叉反应，即rEPF诱导的抗体能否用于人类血清中EPF的检测。为此，我们制备了三种来源的EPF(从孕早期血清中提取的nEPF(nativeEPF)、仓鼠卵巢细胞表达的CHO-EPF、大肠杆菌表达的BL21-EPF)，也用这三种来源的EPF免疫BALB/c小鼠制备抗体，并对其进行检测。
目的：
探讨细胞表达的重组早孕因子(CHO-EPF)、大肠杆菌表达的重组早孕因子(BL21-EPF)和天然早孕因子(Native Early Pregnancy Factor，nEPF)之间的免疫交叉反应，寻找制备EPF抗体比较理想的免疫原。
方法：
(1)构建真核表达体系CHO-pcDNA4.0-EPF和原核表达体系BL21-pET28b-EPF，进行rEPF表达，并用Ni-NTA亲和层析柱纯化，使用SDS-PAGE电泳、Westernblotting、质谱分析鉴定目的蛋白的表达。(2)制备rEPF抗体和nEPF抗体，运用酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)测定其效价及最适抗原抗体工作浓度;(3)运用SDS-PAGE电泳、Westernblotting及ELISA等方法对nEPF抗体、CHO-EPF抗体、BL21-EPF抗体之间的交叉反应进行检测。
结果：
(1)成功构建真核表达体系CHO-pcDNA4.0-EPF和原核表达体系BL21-pET28b-EPF，并获得分子量均为10kda表达产物CHO-EPF和BL21-EPF。(2)成功获得CHO-EPF多抗血清和人源性EPF多抗血清，综合BL21-EPF单抗，ELISA测定效价普遍较高，在1：10000的抗体稀释度下，仍有强显色。运用“棋盘法”确定抗原抗体最佳工作浓度，最后确定最适抗原包被浓度为5ng/μl。(3)交叉反应测试显示：三种来源的EPF抗体效价无显著性差异;原核表达BL21-EPF与nEPF诱导的抗体中BL21-EPF单抗能识别nEPF中26ku和52ku组分，且抗nEPF多抗也能与BL21-EPF中10ku组分反应;真核表达CHO-EPF与nEPF诱导的抗体中CHO-EPF多抗能识别nEPF中10ku和26ku组分，而nEPF抗体不能与CHO-EPF反应;原核表达BL21-EPF与真核表达CHO-EPF诱导的抗体中CHO-EPF多抗能识别BL21-EPF中10ku片段，而BL21-EPF单抗不能与CHO-EPF反应。
结论：
本研究表明CHO-EPF多抗能识别BL21-EPF和nEPF，但BL21-EPF单抗和nEPF多抗却不能识别CHO-EPF。即CHO-EPF多抗更为活跃，识别位点广泛，而BL21-EPF单抗和nEPF多抗对抗原表位的识别相对专一且与CHO-EPF多抗识别区无重合。rEPF抗体与nEPF之间的交叉反应说明其互相结合部位结构的类似，同时也说明只有进一步制作单克隆抗体才能筛选出特异性强的抗体。真核源性EPF、原核源性EPF、人源性EPF既有类似结构，又有明显差异;EPF抗体制备过程中用rEPF替代nEPF作为免疫原是可行的。
早孕因子(Early pregnancy factor，EPF)是一种具有免疫抑制和生长调节活性的妊娠相关蛋白，是目前已明确报道的最早确认妊娠的生化指标[1]。本课题组一直从事EPF研究工作，天然EPF的难获得和分子克隆技术的快速发展，使我们的研究方向愈加倾向于用基因重组的方法制备接近天然构象的重组EPF(Recombinant Early Pregnancy Factor，rEPF)。虽然rEPF的生产较传统提取工艺有明显优势，但由于缺乏EPF分子量、结构、种属来源与抗体识别间关系的研究，目前不能确定来自孕早期血清的人源性EPF和体外重组表达的rEPF诱导的抗体是否具有交叉反应，即rEPF诱导的抗体能否用于人类血清中EPF的检测。为此，我们制备了三种来源的EPF(从孕早期血清中提取的nEPF(nativeEPF)、仓鼠卵巢细胞表达的CHO-EPF、大肠杆菌表达的BL21-EPF)，也用这三种来源的EPF免疫BALB/c小鼠制备抗体，并对其进行检测。
目的：
探讨细胞表达的重组早孕因子(CHO-EPF)、大肠杆菌表达的重组早孕因子(BL21-EPF)和天然早孕因子(Native Early Pregnancy Factor，nEPF)之间的免疫交叉反应，寻找制备EPF抗体比较理想的免疫原。
方法：
(1)构建真核表达体系CHO-pcDNA4.0-EPF和原核表达体系BL21-pET28b-EPF，进行rEPF表达，并用Ni-NTA亲和层析柱纯化，使用SDS-PAGE电泳、Westernblotting、质谱分析鉴定目的蛋白的表达。(2)制备rEPF抗体和nEPF抗体，运用酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)测定其效价及最适抗原抗体工作浓度;(3)运用SDS-PAGE电泳、Westernblotting及ELISA等方法对nEPF抗体、CHO-EPF抗体、BL21-EPF抗体之间的交叉反应进行检测。
结果：
(1)成功构建真核表达体系CHO-pcDNA4.0-EPF和原核表达体系BL21-pET28b-EPF，并获得分子量均为10kda表达产物CHO-EPF和BL21-EPF。(2)成功获得CHO-EPF多抗血清和人源性EPF多抗血清，综合BL21-EPF单抗，ELISA测定效价普遍较高，在1：10000的抗体稀释度下，仍有强显色。运用“棋盘法”确定抗原抗体最佳工作浓度，最后确定最适抗原包被浓度为5ng/μl。(3)交叉反应测试显示：三种来源的EPF抗体效价无显著性差异;原核表达BL21-EPF与nEPF诱导的抗体中BL21-EPF单抗能识别nEPF中26ku和52ku组分，且抗nEPF多抗也能与BL21-EPF中10ku组分反应;真核表达CHO-EPF与nEPF诱导的抗体中CHO-EPF多抗能识别nEPF中10ku和26ku组分，而nEPF抗体不能与CHO-EPF反应;原核表达BL21-EPF与真核表达CHO-EPF诱导的抗体中CHO-EPF多抗能识别BL21-EPF中10ku片段，而BL21-EPF单抗不能与CHO-EPF反应。
结论：
本研究表明CHO-EPF多抗能识别BL21-EPF和nEPF，但BL21-EPF单抗和nEPF多抗却不能识别CHO-EPF。即CHO-EPF多抗更为活跃，识别位点广泛，而BL21-EPF单抗和nEPF多抗对抗原表位的识别相对专一且与CHO-EPF多抗识别区无重合。rEPF抗体与nEPF之间的交叉反应说明其互相结合部位结构的类似，同时也说明只有进一步制作单克隆抗体才能筛选出特异性强的抗体。真核源性EPF、原核源性EPF、人源性EPF既有类似结构，又有明显差异;EPF抗体制备过程中用rEPF替代nEPF作为免疫原是可行的。