研究背景：食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是一种恶性消化道肿瘤，尤其在我国十分常见，其发病率及死亡率都呈逐年升高的趋势。其预后差，5年生存率仅有20%左右，为高致死性疾病。因此研究其发病机制，寻找新的早期诊断及治疗的靶点具有十分重要的意义。DcR3（Decoy receptor3，诱骗受体3）又称为TNFRSF6B（Tumour necrosis factorreceptor super family member6B，肿瘤坏死因子受体超家族成员6B）。该超家族成员通常能促进机体杀伤并清除肿瘤细胞，例如Fas与其配体FasL（TNFSF6）相互作用介导凋亡为体内最常见的凋亡介导模式之一，在机体的免疫监视及肿瘤自身的清除中起着重要作用。与家族里其他分子不同，DcR3并不促进肿瘤的清除，反而拮抗其他分子诱导的细胞凋亡。其原因是DcR3缺乏跨膜区和膜内信号功能区，属分泌蛋白，可以竞争性结合肿瘤坏死因子，但不能向瘤细胞内部传递凋亡诱导信号[1]。这种现象被认为是肿瘤诱骗（decoy）免疫杀伤细胞而逃脱机体免疫监视的重要机制。迄今，至少已发现有3种与肿瘤凋亡相关的重要配体分子FasL，LIGHT和TL1A介导的细胞死亡受到DcR3的拮抗。抑制DcR3的表达可明显促进上述分子对肿瘤细胞的凋亡效应，而诱导DcR3的表达则可以抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤的存活[2][3][4]。多个临床研究发现，正常组织不表达或低表达DcR3，而肿瘤组织高表达DcR3，其高表达程度与肿瘤的发生发展密切相关[5][6][7]。在前期实验中我们检测分析了DcR3表达水平与ESCC发病率的相关性。结果发现，ESCC患者肿瘤组织DcR3表达丰度显著高于正常对照组织，并且DcR3的高表达与ESCC的侵袭和转移相关，提示DcR3的表达增高可能是ESCC发生发展的重要原因之一[8]。进一步，我们进行了DcR3调控区域内SNP多态性与ESCC发病率的关联研究，结果显示，位于DcR3第一外显子区域的SNP rs2257440与ESCC患病率显著相关，提示rs2257440多态性可能通过调控DcR3表达进而影响ESCC患病风险[9]。综合上述关联性研究结果，我们推测：SNP rs2257440为功能性SNP，即rs2257440不同等位基因可能通过影响DcR3基因的表达，最终参与了ESCC的发生发展。为深入阐明SNP rs2257440多态性影响DcR3基因表达的分子机制，我们对SNPrs2257440位点所在区域进行了生物信息学分析。rs2257440位于DcR3第一外显子区域，而基因的调控元件并不仅仅局限于启动子区，在内含子、第一外显子、3’UTR等区域都可能存在影响基因表达的调控元件。已有文献报道，这些区域内的SNP位点可通过与转录因子的结合参与基因的转录调控[10][11][12]。因此，我们利用TESS（Transcription Element Search System）对rs2257440所在DNA序列进行转录因子结合位点的预测，发现其处在金属反应转录因子1（Metal-responsive transcription factor-1，MTF-1）的结合位点上。因此我们推测转录因子MTF-1可能与rs2257440所在DNA序列相互作用而影响DcR3的表达，进而影响ESCC对抗机体的凋亡诱导而逃避免疫杀伤的能力。研究目的：因此，本课题的研究目的旨在探讨rs2257440位点对DcR3基因表达的等位特异性顺式调控作用及其机制。为此，本课题首先构建了含有rs2257440不同等位基因（C/T）的报告基因质粒以及转录因子MTF-1真核表达载体，通过荧光素酶报告基因试验，以明确rs2257440是否为功能性SNP，MTF-1是否与rs2257440位点不同等位基因相互作用而影响基因的表达。进一步转染MTF-1真核表达载体到rs2257440等位基因型不同的食管癌细胞中，检测细胞中DcR3分子的mRNA和蛋白质表达量，以明确MTF-1是否能在细胞水平促进DcR3的表达，且具有等位基因特异性。最后转染MTF-1真核表达载体到rs2257440不同等位基因型食管癌细胞中，以明确过表达MTF-1是否会对rs2257440不同等位基因型食管癌细胞的生物学行为产生差异性影响。方法：第一部分：MTF-1与SNPrs2257440不同等位基因相互作用影响DcR3基因的表达1.构建报告基因质粒：测定教研室现有的食管癌细胞株中rs2257440位点的等位基因型，以该位点为杂合子的细胞株基因组DNA为模板，通过PCR扩增出含有rs2257440不同等位基因（C/T）的DNA片段并构建到质粒PGL3-Basic上，分别命名为PGL3-440BC和PGL3-440BT。2.构建MTF-1真核表达载体：以食管癌EC109细胞的cDNA为模版，PCR扩增出MTF-1的CDS区，构建到质粒pcDNA3.1上，命名为pcDNA3.1-MTF-1。3.双荧光素酶报告基因实验：1）分别转染PGL3-Basic、 PGL3-440BC和PGL3-440BT入EC109细胞，检测细胞相对荧光活性；2）分别共转染pcDNA3.1-MTF-1和上述报告基因质粒入EC109细胞，检测在过表达MTF-1的情况下，细胞相对荧光活性是否改变。4.为探讨rs2257440不同等位基因对DcR3基因表达的影响，本课题选用两株不同的食管癌细胞（EC109和KYSE450）作为实验对象（两株细胞的rs2257440等位基因型不同，EC109为CC，KYSE450为CT）。pcDNA3.1-MTF-1分别转染EC109和KYSE450细胞，采用定量PCR和Western-blot检测细胞中DcR3基因的表达情况。第二部分：MTF-1对SNP rs2257440不同等位基因型食管癌细胞生物功能的影响pcDNA3.1-MTF-1分别转染食管癌细胞EC109（rs2257440为CC）和KYSE450（rs2257440为CT），采用CCK8法、流式细胞术、Edu染色等方法研究过表达MTF-1对rs2257440不同等位基因型食管癌细胞生物学行为的影响。结果：第一部分：MTF-1与SNPrs2257440不同等位基因相互作用影响DcR3基因的表达1.相对于转染PGL3-Basic的对照组，转染PGL3-440BT的细胞的相对荧光活性显著增加，而转染PGL3-440BC的细胞的相对荧光活性未见明显差异。2.共转染pcDNA3.1-MTF-1和PGL3-440BT的细胞的相对荧光活性升高5.9倍，明显高于共转染pcDNA3.1-MTF-1和PGL3-440BC的细胞以及共转染pcDNA3.1-MTF-1和PGL3-Basic的对照组细胞。3.在食管癌KYSE450细胞中，过表达MTF-1促进了DcR3基因的表达，而在食管癌EC109细胞中未发现这一现象。这一结果与报告基因实验结果一致，即转录因子MTF-1与rs2257440不同等位基因相互作用而影响DcR3的表达。第二部分：MTF-1对SNP rs2257440不同等位基因型食管癌细胞生物功能的影响在EC109细胞中过表达MTF-1，可促进细胞生长，抑制细胞的凋亡，诱导细胞G1到S期转换，但对细胞的迁移能力影响不显著。而在KYSE450细胞中上调MTF-1表达量，同样有促进细胞生长和抑制细胞凋亡的作用，但与EC109细胞不同的是，其诱导KYSE450细胞S期到G2期转换，且可明显促进KYSE450细胞的迁移能力。结论：本课题实验结果提示：1）SNP rs2257440为一功能性SNP位点，其T等位基因能与特定的转录因子MTF-1相互作用而影响DcR3基因的表达。2）MTF-1对rs2257440不同等位基因型食管癌细胞生物功能具有差异性影响，过表达MTF-1能明显促进rs2257440为CT的KYSE450细胞的迁移能力，而对rs2257440为CC的EC109细胞的迁移能力无显著影响。