[目的]探索诱导细菌-真菌混合生物膜中持留菌形成的可靠方法,为生物材料表面细菌与真菌混合生物膜中持留机制研究提供可靠的实验模型及研究方法。观察混合生物膜中持留菌的生长情况及特征变化,探讨持留菌对混合生物膜形成及其结构的影响,探究持留菌的形成与成熟生物膜结构之间的关系。[方法]1.利用白色念珠菌标准株ATCC10231和表皮葡萄球菌标准株ATCC35984分别接种并培养至对数生长期后,调整菌液浓度分别至2×106CFU/mL,将两组菌液按体积1:1混合得到各菌浓度均为1×106CFU/mL的混合菌液。混合菌液于钛金属片生物材料表面进行培养,形成白色念珠菌及表皮葡萄球菌附着于生物材料表面的混合生物膜。2.查询相关文献并根据前期实验结果验证最佳诱导浓度及培养时间。分别使用100ug/mL的四环素、庆大霉素、5-氟胞嘧啶、卡泊芬净诱导培养混合生物膜1h以促进持留菌形成,再使用10ug/mL的环丙沙星及两性霉素B杀灭非持留菌。超声洗脱混合生物膜,并分别置于MH琼脂平板、沙氏琼脂平板培养24h,使用平板菌落计数法计数持留菌数量,寻找最佳药物诱导药物,同时行药敏检测排除耐药可能。3.使用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)于24h观察持留菌在细菌-真菌混合生物膜中的形态特征及混合生物膜变化。4.使用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)于24h观察持留菌在混合生物膜结构中所占比例及混合生物膜变化。[结果]1.经四环素、庆大霉素诱导后,混合生物膜中表皮葡萄球菌的持留菌细胞水平较阴性对照组明显提高(P<0.001),四环素组的持留菌细胞水平高于庆大霉素组(63.02%vs 53.60%,P<0.001)。经5-氟胞嘧啶、卡泊芬净诱导后,混合生物膜中白色念珠菌的持留菌细胞水平较阴性对照组明显提高(P<0.001),5-氟胞嘧啶组的持留菌细胞水平高于卡泊芬净组(52.09%vs 34.99%,P<0.001)。药敏检测结果显示表皮葡萄球菌及白色念珠菌对环丙沙星、两性霉素B、红霉素、青霉素、左氧氟沙星等抗生素敏感性无明显变化。2.SEM下观察,可见经诱导的白色念珠菌出现菌体表面出现隆起样改变,经诱导的表皮葡萄球菌细胞出现分裂减少,菌体体积缩小的改变。持留菌比例较高的混合生物膜较阴性对照组表面团块状菌落更多、混合生物膜结构立体性更加突出、混合生物膜复杂性更高。3.活/死菌染色后CLSM观察,可见持留菌比例较高的混合生物膜不会在抗菌药物的作用下被溶解,持留菌比例较低的混合生物膜被大片溶解。混合生物膜厚度空白对照组>实验组>阴性对照组(37.1um vs 15.7um vs 6.3um)。生物膜较薄处持留菌与死菌混杂存在,生物膜较厚处可见大片持留菌。[结论]1.“休眠技术”有助于细菌-真菌混合生物膜中持留菌的形成,其中5-FC、卡泊芬净可有效诱导白色念珠菌持留菌形成,以5-FC效果为佳,四环素、庆大霉素可有效诱导表皮葡萄球菌持留菌形成,以四环素效果为佳。2.混合生物膜中的持留菌会发生形态特征变化,大量持留菌细胞可以避免混合生物膜被抗菌药物破坏。持留菌细胞的产生不依赖于复杂的混合生物膜结构形成,但混合生物膜经诱导产生持留菌细胞会使混合生物膜的结构更加稳定复杂,对抗生素的耐药性更强。