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目的：
细胞焦亡（Pyroptosis）是一种新发现的由急性脑损伤引起的细胞程序性死亡方式，其发生能激活并促进炎性因子IL-1β，IL-6和IL-18的激活和分泌，同时焦亡的细胞细胞膜在破裂前具有明显的气泡特点并释放焦亡小体。之前已有研究表明石斛碱在体外实验中对OGD/R引起的海马神经元细胞损伤具有一定的神经保护作用，但其机制不明。
本课题将研究石斛碱是否能通过减少神经元焦亡和降低炎症反应的方式来改善脑缺血再灌注引起的损伤。
方法：
1. 体外实验：体外培养Ht22细胞系，然后将细胞随机分为9组：无任何处理的正常对照组（Control组），OGD/R组, OGD/R+低剂量DNLA治疗组（0.03 mg/ml），OGD/R+中剂量DNLA治疗组（0.3 mg/ml）， OGD/R+高剂量DNLA治疗组（ 3 mg/ml ） , OGD/R+焦亡相关蛋白Caspase-1的抑制剂VX765组（10 ng/ml），OGD过程中培养基加入聚乙二醇PEG3000（1%）后再灌注组，OGD/R后培养基中加入PEG3000 （1%）组，OGD/R+PEG3000（1%）组。对 Ht22细胞氧糖剥夺 2 h 后复糖复氧 24 h 建立 OGD/R 模型; DNLA自氧糖剥夺前12h开始即加入并持续到复氧复糖结束；VX765则自氧糖剥夺开始即加入并持续到复糖复氧结束。我们采用了MTT法检测细胞活性以及乳酸脱氢酶(LDH)法测定细胞损伤率，流式细胞技术Annexin V FIFT/PI双染测量细胞坏死和焦亡率，Western-blot法检测焦（Pyroptosis）相关蛋白Caspase-1,GSDMD和GSDMD-C的表达以及与焦亡相关的炎症因子白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）, 白细胞介素6（Interleukin-6， IL-6）, 白细胞介素18（Interleukin-18，IL-18）的表达，免疫荧光染色法检测海马神经元Caspase-1的表达情况，扫描电镜（SEM）观察Ht22细胞的焦亡情况。
2. 体内实验：我们分别用石斛碱(0.03、0.3、3 mg/ml，提前24 h)， MCC950(10 ng /ml，提前1h给药，)，VX765(10 ng /ml，提前1h给药)预处理HT22细胞，然后再将细胞进行缺氧糖剥夺2h，再灌24h后，检测细胞坏死和焦亡以及神经病理变化。为了进一步研究石斛碱的神经保护作用，在体内实验中，我们用不同浓度的石斛生物碱(0.5, 5 mg/kg, ip.提前24h给药)及VX765(50 mg/kg, ip. , 提前1h给药) 预处理C57 B/L 雄性小鼠，然后将小鼠进行中脑动脉栓塞术（MCAO），缺血1h再灌24h。
结果：
实验结果表明：1. DNLA治疗组小鼠的神经行为学评分，脑梗死体积以及焦亡细胞数均有减少，细胞炎症因子IL-1β，IL-6 ，IL-18和焦亡相关蛋白Caspase-1和GSDMD表达量也有明显降低，在小鼠大脑海马CA1区表现尤为明显。紧密连接蛋白Pannexin-1蛋白表达量在DNLA的调控下也有所降低，表明DNLA能改善CIR引起的大脑神经元超微结构损伤情况。2. 在OGD/R组OGD/R诱导Ht22细胞损伤后通过扫描电镜（SEM）观察到细胞焦亡现象，与 Control 组相比，OGD/R组细胞活性下降，细胞损伤率升高，焦亡相关蛋白Caspase-1,GSDMD以及GSDMD-C蛋白的表达量明显升高，炎症因子IL-1β，IL-6,IL-18的蛋白表达量亦明显增加,PEG3000组细胞存活率和损伤率均无明显变化；与OGD/R组相比，DNLA治疗组的组细胞活性均有升高，细胞损伤率显著降低，以高剂量 DNLA 组最为明显，焦亡相关蛋白Caspase-1,GSDMD的蛋白表达量降低，GSDMD-C蛋白表达量升高，炎症因子IL-1β，IL-6,IL-18的蛋白表达量降低，VX765抑制剂组的细胞存活率也有所上升，细胞损伤率降低，焦亡相关蛋白Caspase-1,GSDMD蛋白的表达量有所降低，GSDMD-C蛋白的表达量升高，炎症因子IL-1β，IL-6,IL-18的蛋白表达量亦降低，有趣的是OGD过程中培养基加入聚乙二醇PEG3000（1%）后再灌注组和OGD/R后培养基中加入PEG3000（1%）组细胞存活率均有增加，损伤率都有下降。
结论：
研究结果表明：DNLA可通过减少急性脑损伤引起的神经元焦亡从而对脑缺血损伤起到潜在的治疗作用，其机制可能与抑制焦亡相关蛋白Caspase-1的表达有关DNLA为脑急性损伤的治疗提供了新的思路。
细胞焦亡（Pyroptosis）是一种新发现的由急性脑损伤引起的细胞程序性死亡方式，其发生能激活并促进炎性因子IL-1β，IL-6和IL-18的激活和分泌，同时焦亡的细胞细胞膜在破裂前具有明显的气泡特点并释放焦亡小体。之前已有研究表明石斛碱在体外实验中对OGD/R引起的海马神经元细胞损伤具有一定的神经保护作用，但其机制不明。
本课题将研究石斛碱是否能通过减少神经元焦亡和降低炎症反应的方式来改善脑缺血再灌注引起的损伤。
方法：
1. 体外实验：体外培养Ht22细胞系，然后将细胞随机分为9组：无任何处理的正常对照组（Control组），OGD/R组, OGD/R+低剂量DNLA治疗组（0.03 mg/ml），OGD/R+中剂量DNLA治疗组（0.3 mg/ml）， OGD/R+高剂量DNLA治疗组（ 3 mg/ml ） , OGD/R+焦亡相关蛋白Caspase-1的抑制剂VX765组（10 ng/ml），OGD过程中培养基加入聚乙二醇PEG3000（1%）后再灌注组，OGD/R后培养基中加入PEG3000 （1%）组，OGD/R+PEG3000（1%）组。对 Ht22细胞氧糖剥夺 2 h 后复糖复氧 24 h 建立 OGD/R 模型; DNLA自氧糖剥夺前12h开始即加入并持续到复氧复糖结束；VX765则自氧糖剥夺开始即加入并持续到复糖复氧结束。我们采用了MTT法检测细胞活性以及乳酸脱氢酶(LDH)法测定细胞损伤率，流式细胞技术Annexin V FIFT/PI双染测量细胞坏死和焦亡率，Western-blot法检测焦（Pyroptosis）相关蛋白Caspase-1,GSDMD和GSDMD-C的表达以及与焦亡相关的炎症因子白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）, 白细胞介素6（Interleukin-6， IL-6）, 白细胞介素18（Interleukin-18，IL-18）的表达，免疫荧光染色法检测海马神经元Caspase-1的表达情况，扫描电镜（SEM）观察Ht22细胞的焦亡情况。
2. 体内实验：我们分别用石斛碱(0.03、0.3、3 mg/ml，提前24 h)， MCC950(10 ng /ml，提前1h给药，)，VX765(10 ng /ml，提前1h给药)预处理HT22细胞，然后再将细胞进行缺氧糖剥夺2h，再灌24h后，检测细胞坏死和焦亡以及神经病理变化。为了进一步研究石斛碱的神经保护作用，在体内实验中，我们用不同浓度的石斛生物碱(0.5, 5 mg/kg, ip.提前24h给药)及VX765(50 mg/kg, ip. , 提前1h给药) 预处理C57 B/L 雄性小鼠，然后将小鼠进行中脑动脉栓塞术（MCAO），缺血1h再灌24h。
结果：
实验结果表明：1. DNLA治疗组小鼠的神经行为学评分，脑梗死体积以及焦亡细胞数均有减少，细胞炎症因子IL-1β，IL-6 ，IL-18和焦亡相关蛋白Caspase-1和GSDMD表达量也有明显降低，在小鼠大脑海马CA1区表现尤为明显。紧密连接蛋白Pannexin-1蛋白表达量在DNLA的调控下也有所降低，表明DNLA能改善CIR引起的大脑神经元超微结构损伤情况。2. 在OGD/R组OGD/R诱导Ht22细胞损伤后通过扫描电镜（SEM）观察到细胞焦亡现象，与 Control 组相比，OGD/R组细胞活性下降，细胞损伤率升高，焦亡相关蛋白Caspase-1,GSDMD以及GSDMD-C蛋白的表达量明显升高，炎症因子IL-1β，IL-6,IL-18的蛋白表达量亦明显增加,PEG3000组细胞存活率和损伤率均无明显变化；与OGD/R组相比，DNLA治疗组的组细胞活性均有升高，细胞损伤率显著降低，以高剂量 DNLA 组最为明显，焦亡相关蛋白Caspase-1,GSDMD的蛋白表达量降低，GSDMD-C蛋白表达量升高，炎症因子IL-1β，IL-6,IL-18的蛋白表达量降低，VX765抑制剂组的细胞存活率也有所上升，细胞损伤率降低，焦亡相关蛋白Caspase-1,GSDMD蛋白的表达量有所降低，GSDMD-C蛋白的表达量升高，炎症因子IL-1β，IL-6,IL-18的蛋白表达量亦降低，有趣的是OGD过程中培养基加入聚乙二醇PEG3000（1%）后再灌注组和OGD/R后培养基中加入PEG3000（1%）组细胞存活率均有增加，损伤率都有下降。
结论：
研究结果表明：DNLA可通过减少急性脑损伤引起的神经元焦亡从而对脑缺血损伤起到潜在的治疗作用，其机制可能与抑制焦亡相关蛋白Caspase-1的表达有关DNLA为脑急性损伤的治疗提供了新的思路。