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目的：
研究鹿茸活性成分对软骨细胞Sox9基因转录调控作用及生物学机制。
方法：
用匀浆、低温浸提和冷冻干燥的方法制备快速生长期鹿茸提取物（DAE），采用SDS-PAGE和Bradford法进行定性和定量分析，采用iTRAQ法进行蛋白组分分析。利用qRT-PCR法检测鹿茸提取物处理后的软骨细胞中Sox9、Runx3基因表达水平，利用阿利新蓝染色、双荧光素酶检测等方法研究过表达及沉默Runx3对软骨细胞的调控作用。利用高通量RNA-Seq技术结合生物信息学分析方法，分析过表达及沉默Runx3后的原代软骨细胞的基因表达模式，并进行相关功能注释和代谢通路分析。最后，利用qRT-PCR法对RNA-Seq所测基因表达水平验证。
结果：
（1）SDS-PAGE和Bradford定量染色结果表明快速生长期的鹿茸提取物（DAE）主要为蛋白质类成分，含量可达69.14%；蛋白组分分析结果表明DAE中主要包含跨膜糖蛋白NMB、过氧化物还原酶-6、S-腺苷甲硫氨酸合酶-5、胰岛素样生长因子结合蛋白-5等与软骨生长发育相关的蛋白。
（2）CCK8结果表明DAE在0.64mg/ml浓度时，可显著促进软骨细胞增殖，且作用效果最佳。qRT-PCR实验结果表明，与空白对照组相比，DAE处理后的软骨细胞Runx3基因表达水平降低，而Sox9基因表达水平升高。
（3）qRT-PCR实验结果表明，在软骨细胞中过表达或沉默Runx3可显著改变Runx3基因表达水平。且阿利新蓝染色实验证明过表达Runx3抑制软骨细胞增殖及细胞外基质合成，而Runx3沉默结果相反。
（4）双荧光素酶检测表明Runx3可能通过调节Sox9软骨特异性增强子从而调节Sox9及其下游基因Col2a1、Acan、Col9a1、Col11a1、Hapln1的表达水平。
（5）对转录组进行生物信息学分析，鉴定差异表达基因，结果表明，与空白组相比，Runx3过表达组鉴定出17个差异表达基因，包括除Runx3外的4个上调基因和12个下调基因。而Runx3沉默组鉴定出189个差异表达基因，包括除了Runx3之外的80个上调基因和108个下调基因。
（6）对差异表达基因进行筛选分析发现，在Runx3过表达的条件下，软骨细胞增殖标记物，如Comp、Matn1、Ptch1和Fgfr3的表达水平下调，而在Runx3沉默的条件下，这些基因的表达水平上调。在Runx3过表达的条件下，软骨细胞分化标记物的表达水平，如Pth1r、Ihh、Col10a1、Mmp13、Runx2、Sp7和Bmp6的表达水平上调，而在Runx3沉默的条件下，这些基因的表达水平下调。
（7）qRT-PCR实验结果与转录组测序结果一致，证明转录组测序结果真实可信。
结论：
本研究制备的快速生长期鹿茸提取物主要为蛋白质类成分，其核心功效成分为跨膜糖蛋白NMB、过氧化物还原酶-6、S-腺苷甲硫氨酸合酶-5、胰岛素样生长因子结合蛋白-5等参与软骨生长发育相关的蛋白；DAE对软骨细胞增殖及分化的调控主要是通过下调Runx3转录因子，进而上调Sox9及其下游靶基因，如Col2a1、Acan、Col9a1、Col11a1、Hapln1等的表达水平。而Runx3作为Sox9的转录抑制因子，主要是通过抑制Sox9上游非编码区的软骨增强子序列元件进而实现对Sox9的转录调控；综上，DAE可以抑制Runx3所诱导的软骨细胞分化，进而促进软骨细胞增殖及胞外基质合成。因此，本研究结果表明DAE可以作为潜在的软骨生长激动剂，其作用机理可能是通过抑制Sox9抑制因子Runx3，进而促进软骨细胞增殖和胞外基质合成，抑制软骨细胞分化。
研究鹿茸活性成分对软骨细胞Sox9基因转录调控作用及生物学机制。
方法：
用匀浆、低温浸提和冷冻干燥的方法制备快速生长期鹿茸提取物（DAE），采用SDS-PAGE和Bradford法进行定性和定量分析，采用iTRAQ法进行蛋白组分分析。利用qRT-PCR法检测鹿茸提取物处理后的软骨细胞中Sox9、Runx3基因表达水平，利用阿利新蓝染色、双荧光素酶检测等方法研究过表达及沉默Runx3对软骨细胞的调控作用。利用高通量RNA-Seq技术结合生物信息学分析方法，分析过表达及沉默Runx3后的原代软骨细胞的基因表达模式，并进行相关功能注释和代谢通路分析。最后，利用qRT-PCR法对RNA-Seq所测基因表达水平验证。
结果：
（1）SDS-PAGE和Bradford定量染色结果表明快速生长期的鹿茸提取物（DAE）主要为蛋白质类成分，含量可达69.14%；蛋白组分分析结果表明DAE中主要包含跨膜糖蛋白NMB、过氧化物还原酶-6、S-腺苷甲硫氨酸合酶-5、胰岛素样生长因子结合蛋白-5等与软骨生长发育相关的蛋白。
（2）CCK8结果表明DAE在0.64mg/ml浓度时，可显著促进软骨细胞增殖，且作用效果最佳。qRT-PCR实验结果表明，与空白对照组相比，DAE处理后的软骨细胞Runx3基因表达水平降低，而Sox9基因表达水平升高。
（3）qRT-PCR实验结果表明，在软骨细胞中过表达或沉默Runx3可显著改变Runx3基因表达水平。且阿利新蓝染色实验证明过表达Runx3抑制软骨细胞增殖及细胞外基质合成，而Runx3沉默结果相反。
（4）双荧光素酶检测表明Runx3可能通过调节Sox9软骨特异性增强子从而调节Sox9及其下游基因Col2a1、Acan、Col9a1、Col11a1、Hapln1的表达水平。
（5）对转录组进行生物信息学分析，鉴定差异表达基因，结果表明，与空白组相比，Runx3过表达组鉴定出17个差异表达基因，包括除Runx3外的4个上调基因和12个下调基因。而Runx3沉默组鉴定出189个差异表达基因，包括除了Runx3之外的80个上调基因和108个下调基因。
（6）对差异表达基因进行筛选分析发现，在Runx3过表达的条件下，软骨细胞增殖标记物，如Comp、Matn1、Ptch1和Fgfr3的表达水平下调，而在Runx3沉默的条件下，这些基因的表达水平上调。在Runx3过表达的条件下，软骨细胞分化标记物的表达水平，如Pth1r、Ihh、Col10a1、Mmp13、Runx2、Sp7和Bmp6的表达水平上调，而在Runx3沉默的条件下，这些基因的表达水平下调。
（7）qRT-PCR实验结果与转录组测序结果一致，证明转录组测序结果真实可信。
结论：
本研究制备的快速生长期鹿茸提取物主要为蛋白质类成分，其核心功效成分为跨膜糖蛋白NMB、过氧化物还原酶-6、S-腺苷甲硫氨酸合酶-5、胰岛素样生长因子结合蛋白-5等参与软骨生长发育相关的蛋白；DAE对软骨细胞增殖及分化的调控主要是通过下调Runx3转录因子，进而上调Sox9及其下游靶基因，如Col2a1、Acan、Col9a1、Col11a1、Hapln1等的表达水平。而Runx3作为Sox9的转录抑制因子，主要是通过抑制Sox9上游非编码区的软骨增强子序列元件进而实现对Sox9的转录调控；综上，DAE可以抑制Runx3所诱导的软骨细胞分化，进而促进软骨细胞增殖及胞外基质合成。因此，本研究结果表明DAE可以作为潜在的软骨生长激动剂，其作用机理可能是通过抑制Sox9抑制因子Runx3，进而促进软骨细胞增殖和胞外基质合成，抑制软骨细胞分化。