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目的：卵巢癌是发病率排第二位的女性恶性妇科肿瘤，但是其死亡率却居妇科恶性肿瘤第一位。尽管积极的外科手术干预并引用化疗敏感的药物，但易耐药、复发转移率高导致目前治疗结果仍不满意。复发、侵袭及转移是导致卵巢癌患者治疗失败和死亡率居高不下的主要原因。近年来，Girdin成为恶性肿瘤研究的热点，它广泛参与多种恶性肿瘤的侵袭、转移、血管生成等多个进程。众所周知，AKT激酶是胰岛素信号的重要介质，而Girdin作为AKT激酶的底物已被证实参与了胰岛素信号的调控。大量的国内外临床回顾性研究及基础性研究均发现二甲双胍具有多种癌症的抗肿瘤特性，而二甲双胍作为一种广泛使用的抗2型糖尿病的药物与Girdin之间必然存在一定的相关性。那么，在恶性肿瘤中他们的作用及相互关系如何？目前，国内外尚未见二甲双胍与Girdin在恶性肿瘤中相关关系的研究报道。本研究拟通过在上皮性卵巢癌组织及卵巢癌细胞株中检测 Girdin 的表达，深入研究认识Girdin在上皮性卵巢癌侵袭、转移过程中的作用及其分子机制，并通过体内外实验进一步探讨二甲双胍与Girdin在上皮性卵巢癌发生、发展中的作用及其相互关系，以期为早期诊断卵巢癌的复发、侵袭及转移提供依据，同时也将为卵巢癌的靶向治疗提供新的研究方向。
方法：
第一部分（1）qRT-PCR及免疫组化法检测30例上皮性卵巢癌及30例正常卵巢组织中Girdin的表达，并分析在上皮性卵巢癌组织中Girdin的表达水平与临床病理特征的关系；（2）选取卵巢癌细胞株CAOV3、A2780、OVCAR3、SKOV3和卵巢上皮细胞IOSE80，qRT-PCR和Western blot法检测Girdin的表达。
第二部分（1）构建Girdin干扰（3个位点）慢病毒转染SKOV3和A2780细胞， Girdin过表达慢病毒转染OVCAR3细胞，qRT-PCR和Western blot法检测Girdin干扰和过表达效率；（2）Girdin基因干扰的SKOV3和A2780细胞株，CCK8法检测细胞增殖，Transwell法检测细胞侵袭和迁移，qRT-PCR法检测MMP2和MMP9的表达，Western blot法检测AKT、p-AKT、MMP2和MMP9的表达；（3）Girdin基因过表达的OVCAR3细胞株，联合25μmol/L的AKT抑制剂LY294002共培养， CCK8法检测细胞增殖，Transwell法检测细胞侵袭和迁移，qRT-PCR法检测MMP2和MMP9的表达，Western blot法检测AKT、p-AKT、MMP2和MMP9的表达。
第三部分（1）使用0、0.25、0.5、1、2.5和5nM浓度的二甲双胍处理OVCAR3细胞株，CCK8法检测细胞增殖，qRT-PCR法检测Girdin的表达，Western blot法检测Girdin和p-Girdin的表达；（2）Girdin基因过表达的OVCAR3细胞株，联合0.5nM浓度的二甲双胍处理，CCK8法检测细胞增殖，Transwell法检测细胞侵袭和迁移， qRT-PCR法检测MMP2和MMP9的表达，Western blot法检测AKT、p-AKT、MMP2和MMP9的表达；（3）Girdin基因过表达的OVCAR3细胞尾静脉注射细胞构建裸鼠肺转移瘤模型（每组6只），空载和过表达组分别使用200mg/Kg/d的二甲双胍灌胃干预，取肺组织HE染色分析转移情况。
结果：
第一部分（1）应用免疫组化法检测结果发现 Girdin 在上皮性卵巢癌组织中明显高表达。应用qRT-PCR法检测结果发现Girdin mRNA在上皮性卵巢癌中的表达为 0.029±0.0038，而其在正常卵巢组织中的表达为 0.017±0.0032，两组数据之间采用t检验，P=0.0148﹤0.05，差异具有统计学意义；同时发现Girdin的表达与患者的年龄、肿瘤大小及组织学类型无明显相关性，差异无统计学意义；而与肿瘤的FIGO分期、分化程度以及有无远处转移有显著相关性，差异具有统计学意义（均P﹤0.05）。（2）利用qRT-PCR和Western blot法检测结果发现Girdin在OVCAR3细胞中低表达，而在CAOV3细胞、A2780细胞及SKOV3细胞中高表达，且在SKOV3细胞中表达最高。
第二部分（1）构建稳定转染 Girdin 的干扰慢病毒 siGirdin-1、siGirdin-2、siGirdin-3，分别转染SKOV3细胞和A2780细胞，Western Blot法及qRT-PCR法检测结果发现与空白对照组及空载慢病毒转染组相比，siGirdin-1、siGirdin-2、siGirdin-3干扰组 Girdin 的表达水平显著下降，P﹤0.05，差异具有统计学意义；构建稳定转染Girdin的过表达慢病毒，成功转染OVCAR3细胞，Western Blot法及qRT-PCR法检测转染后OVCAR3细胞结果发现与空白对照组、Vector(转染空载慢病毒)组相比，oe_Girdin（转染Girdin过表达慢病毒）组Girdin的表达显著升高，P＜0.05,差异具有统计学意义；（2）在稳定转染Girdin干扰慢病毒的SKOV3细胞及A2780细胞中分别选取siNC、siGirdin-1及siGirdin-2组，CCK8检测各组细胞培养0h、24h、48h 及 72h 后的增殖能力变化，结果发现与 siNC 组相比，siGirdin-1 及 siGirdin-2组细胞随时时间延长增殖能力明显下降；Transwell检测结果发现与siNC组相比， siGirdin-1及siGirdin-2组细胞的侵袭、转移能力均明显下降，P＜0.05，差异具有统计学意义；应用qRT-PCR法检测MMP2和MMP9的表达，结果发现与siNC组相比，siGirdin-1及siGirdin-2组细胞MMP2 mRNA及MMP9 mRNA的表达水平均明显下降，P＜0.05，差异具有统计学意义；应用Western Blot法检测AKT、p-AKT、MMP2和MMP9的表达，结果发现与siNC组相比，siGirdin-1及siGirdin-2组细胞P-AKT/AKT 的表达明显下降，P＜0.05，差异具有统计学意义；与 siNC 组相比， siGirdin-1及siGirdin-2组细胞的MMP2、MMP9的蛋白表达水平也显著下降。（3）选取 OVCAR3 细胞 Vector、oe_Girdin、Vector+LY294002 及 oe_Girdin+LY294002组，CCK8 检测各组细胞增殖能力变化，结果发现与 Vector 组相比，oe_Girdin 组OVCAR3细胞增殖能力明显增强，而Vector+LY294002及oe_Girdin+LY294002组OVCAR3 细胞增殖能力显著下降；Transwell 检测细胞的侵袭及转移能力变化，结果发现与Vector组细胞相比，oe_Girdin组细胞的侵袭、转移能力显著增强，P＜0.05，差异具有统计学意义，而Vector+LY294002组及oe_Girdin+LY294002组细胞的侵袭、转移能力显著减弱，P＜0.05，差异具有统计学意义；应用qRT-PCR法检测MMP2 mRNA和MMP9 mRNA的表达情况，结果发现与Vector组细胞相比，oe_Girdin组细胞中MMP2 mRNA、MMP9 mRNA的表达水平显著升高，P＜0.05，差异具有统计学意义，而Vector+LY294002组细胞中MMP2 mRNA、MMP9 mRNA的表达水平显著下降，P＜0.05，差异具有统计学意义；应用Western Blot法检测AKT、p-AKT、MMP2和MMP9的表达情况，结果发现与Vector组细胞相比，oe_Girdin组细胞中p-AKT/AKT、MMP2和MMP9蛋白的表达水平明显升高，P＜0.05，差异具有统计学意义，而 Vector+LY294002 组及 oe_Girdin+LY294002 组细胞中 p-AKT/AKT、MMP2和MMP9蛋白的表达水平显著下降，P＜0.05，差异具有统计学意义。
第三部分（1）使用0、0.25、0.5、1、2.5和5nM的二甲双胍与OVCAR3细胞共培养，CCK8法检测各组细胞的增殖能力变化发现随着培养时间的延长，二甲双胍的浓度越高对OVCAR3细胞的增殖能力的抑制越明显；qRT-PCR法检测结果发现各组OVCAR3细胞中Girdin mRNA的表达水平随着二甲双胍浓度的增加反而降低，二甲双胍浓度越高这种抑制作用越明显；Western blot法检测各组OVCAR3细胞中 Girdin 和 p-Girdin 的表达情况，结果发现随着二甲双胍浓度的增加， P-Girdin/Girdin的表达水平均呈升高趋势；（2）在OVCAR3细胞株中，选取Vector、oe_Girdin、Vector+Metformin及oe_Girdin+ Metformin组，CCK8检测各组细胞增殖能力变化，结果发现与 Vector 组相比，oe_Girdin 组细胞增殖能力明显增强， oe_Girdin+ Metformin组细胞的增殖能力稍强，但弱于oe_Girdin组细胞，而Vector+Metformin组细胞增殖能力显著下降；Transwell检测细胞的侵袭及转移能力变化，结果发现与Vector组细胞相比，oe_Girdin组细胞的侵袭转移能力显著增强，P＜0.05，差异具有统计学意义，Vector+Metformin组细胞的侵袭转移能力显著减弱，P＜0.05，差异具有统计学意义，oe_Girdin+Metformin 组细胞的侵袭转移能力变化不大，P＞0.05，差异无统计学意义；应用qRT-PCR法及Western Blot法检测发现，与Vector组细胞相比，oe_Girdin组细胞中p-AKT/AKT、MMP2和MMP9的表达水平明显升高，P＜0.05，差异具有统计学意义，而Vector+Metformin组细胞中p-AKT/AKT、MMP2 和 MMP9 的表达水平显著下降， P＜0.05 ，差异具有统计学意义，oe_Girdin+Metformin组细胞中P-AKT/AKT的表达水平变化不大，P＞0.05，差异无统计学意义，MMP9的表达水平明显降低，P＜0.05，差异具有统计学意义，而 MMP2的表达水平变化不大，P＞0.05，差异无统计学意义；（3）稳定转染 Girdin 基因过表达慢病毒的 OVCAR3 细胞株经尾静脉注射细胞构建裸鼠肺转移瘤模型，空载和过表达组分别使用 200mg/Kg/d 的二甲双胍灌胃干预，对照组予生理盐水干预，5周后取肺组织HE染色，镜下观察转移结节数量。结果发现二甲双胍干预后与对照相比，肿瘤转移结节数目显著减少。
结论：1、Girdin 在上皮性卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中高表达，并与卵巢癌患者的病理分化程度、临床分期及远处转移具有显著相关性。2、AKT/Girdin 信号通路参与调控卵巢癌细胞株的增殖、侵袭及转移各个进程。3、二甲双胍可以通过调控Girdin的表达及磷酸化抑制卵巢癌细胞的侵袭及转移。
方法：
第一部分（1）qRT-PCR及免疫组化法检测30例上皮性卵巢癌及30例正常卵巢组织中Girdin的表达，并分析在上皮性卵巢癌组织中Girdin的表达水平与临床病理特征的关系；（2）选取卵巢癌细胞株CAOV3、A2780、OVCAR3、SKOV3和卵巢上皮细胞IOSE80，qRT-PCR和Western blot法检测Girdin的表达。
第二部分（1）构建Girdin干扰（3个位点）慢病毒转染SKOV3和A2780细胞， Girdin过表达慢病毒转染OVCAR3细胞，qRT-PCR和Western blot法检测Girdin干扰和过表达效率；（2）Girdin基因干扰的SKOV3和A2780细胞株，CCK8法检测细胞增殖，Transwell法检测细胞侵袭和迁移，qRT-PCR法检测MMP2和MMP9的表达，Western blot法检测AKT、p-AKT、MMP2和MMP9的表达；（3）Girdin基因过表达的OVCAR3细胞株，联合25μmol/L的AKT抑制剂LY294002共培养， CCK8法检测细胞增殖，Transwell法检测细胞侵袭和迁移，qRT-PCR法检测MMP2和MMP9的表达，Western blot法检测AKT、p-AKT、MMP2和MMP9的表达。
第三部分（1）使用0、0.25、0.5、1、2.5和5nM浓度的二甲双胍处理OVCAR3细胞株，CCK8法检测细胞增殖，qRT-PCR法检测Girdin的表达，Western blot法检测Girdin和p-Girdin的表达；（2）Girdin基因过表达的OVCAR3细胞株，联合0.5nM浓度的二甲双胍处理，CCK8法检测细胞增殖，Transwell法检测细胞侵袭和迁移， qRT-PCR法检测MMP2和MMP9的表达，Western blot法检测AKT、p-AKT、MMP2和MMP9的表达；（3）Girdin基因过表达的OVCAR3细胞尾静脉注射细胞构建裸鼠肺转移瘤模型（每组6只），空载和过表达组分别使用200mg/Kg/d的二甲双胍灌胃干预，取肺组织HE染色分析转移情况。
结果：
第一部分（1）应用免疫组化法检测结果发现 Girdin 在上皮性卵巢癌组织中明显高表达。应用qRT-PCR法检测结果发现Girdin mRNA在上皮性卵巢癌中的表达为 0.029±0.0038，而其在正常卵巢组织中的表达为 0.017±0.0032，两组数据之间采用t检验，P=0.0148﹤0.05，差异具有统计学意义；同时发现Girdin的表达与患者的年龄、肿瘤大小及组织学类型无明显相关性，差异无统计学意义；而与肿瘤的FIGO分期、分化程度以及有无远处转移有显著相关性，差异具有统计学意义（均P﹤0.05）。（2）利用qRT-PCR和Western blot法检测结果发现Girdin在OVCAR3细胞中低表达，而在CAOV3细胞、A2780细胞及SKOV3细胞中高表达，且在SKOV3细胞中表达最高。
第二部分（1）构建稳定转染 Girdin 的干扰慢病毒 siGirdin-1、siGirdin-2、siGirdin-3，分别转染SKOV3细胞和A2780细胞，Western Blot法及qRT-PCR法检测结果发现与空白对照组及空载慢病毒转染组相比，siGirdin-1、siGirdin-2、siGirdin-3干扰组 Girdin 的表达水平显著下降，P﹤0.05，差异具有统计学意义；构建稳定转染Girdin的过表达慢病毒，成功转染OVCAR3细胞，Western Blot法及qRT-PCR法检测转染后OVCAR3细胞结果发现与空白对照组、Vector(转染空载慢病毒)组相比，oe_Girdin（转染Girdin过表达慢病毒）组Girdin的表达显著升高，P＜0.05,差异具有统计学意义；（2）在稳定转染Girdin干扰慢病毒的SKOV3细胞及A2780细胞中分别选取siNC、siGirdin-1及siGirdin-2组，CCK8检测各组细胞培养0h、24h、48h 及 72h 后的增殖能力变化，结果发现与 siNC 组相比，siGirdin-1 及 siGirdin-2组细胞随时时间延长增殖能力明显下降；Transwell检测结果发现与siNC组相比， siGirdin-1及siGirdin-2组细胞的侵袭、转移能力均明显下降，P＜0.05，差异具有统计学意义；应用qRT-PCR法检测MMP2和MMP9的表达，结果发现与siNC组相比，siGirdin-1及siGirdin-2组细胞MMP2 mRNA及MMP9 mRNA的表达水平均明显下降，P＜0.05，差异具有统计学意义；应用Western Blot法检测AKT、p-AKT、MMP2和MMP9的表达，结果发现与siNC组相比，siGirdin-1及siGirdin-2组细胞P-AKT/AKT 的表达明显下降，P＜0.05，差异具有统计学意义；与 siNC 组相比， siGirdin-1及siGirdin-2组细胞的MMP2、MMP9的蛋白表达水平也显著下降。（3）选取 OVCAR3 细胞 Vector、oe_Girdin、Vector+LY294002 及 oe_Girdin+LY294002组，CCK8 检测各组细胞增殖能力变化，结果发现与 Vector 组相比，oe_Girdin 组OVCAR3细胞增殖能力明显增强，而Vector+LY294002及oe_Girdin+LY294002组OVCAR3 细胞增殖能力显著下降；Transwell 检测细胞的侵袭及转移能力变化，结果发现与Vector组细胞相比，oe_Girdin组细胞的侵袭、转移能力显著增强，P＜0.05，差异具有统计学意义，而Vector+LY294002组及oe_Girdin+LY294002组细胞的侵袭、转移能力显著减弱，P＜0.05，差异具有统计学意义；应用qRT-PCR法检测MMP2 mRNA和MMP9 mRNA的表达情况，结果发现与Vector组细胞相比，oe_Girdin组细胞中MMP2 mRNA、MMP9 mRNA的表达水平显著升高，P＜0.05，差异具有统计学意义，而Vector+LY294002组细胞中MMP2 mRNA、MMP9 mRNA的表达水平显著下降，P＜0.05，差异具有统计学意义；应用Western Blot法检测AKT、p-AKT、MMP2和MMP9的表达情况，结果发现与Vector组细胞相比，oe_Girdin组细胞中p-AKT/AKT、MMP2和MMP9蛋白的表达水平明显升高，P＜0.05，差异具有统计学意义，而 Vector+LY294002 组及 oe_Girdin+LY294002 组细胞中 p-AKT/AKT、MMP2和MMP9蛋白的表达水平显著下降，P＜0.05，差异具有统计学意义。
第三部分（1）使用0、0.25、0.5、1、2.5和5nM的二甲双胍与OVCAR3细胞共培养，CCK8法检测各组细胞的增殖能力变化发现随着培养时间的延长，二甲双胍的浓度越高对OVCAR3细胞的增殖能力的抑制越明显；qRT-PCR法检测结果发现各组OVCAR3细胞中Girdin mRNA的表达水平随着二甲双胍浓度的增加反而降低，二甲双胍浓度越高这种抑制作用越明显；Western blot法检测各组OVCAR3细胞中 Girdin 和 p-Girdin 的表达情况，结果发现随着二甲双胍浓度的增加， P-Girdin/Girdin的表达水平均呈升高趋势；（2）在OVCAR3细胞株中，选取Vector、oe_Girdin、Vector+Metformin及oe_Girdin+ Metformin组，CCK8检测各组细胞增殖能力变化，结果发现与 Vector 组相比，oe_Girdin 组细胞增殖能力明显增强， oe_Girdin+ Metformin组细胞的增殖能力稍强，但弱于oe_Girdin组细胞，而Vector+Metformin组细胞增殖能力显著下降；Transwell检测细胞的侵袭及转移能力变化，结果发现与Vector组细胞相比，oe_Girdin组细胞的侵袭转移能力显著增强，P＜0.05，差异具有统计学意义，Vector+Metformin组细胞的侵袭转移能力显著减弱，P＜0.05，差异具有统计学意义，oe_Girdin+Metformin 组细胞的侵袭转移能力变化不大，P＞0.05，差异无统计学意义；应用qRT-PCR法及Western Blot法检测发现，与Vector组细胞相比，oe_Girdin组细胞中p-AKT/AKT、MMP2和MMP9的表达水平明显升高，P＜0.05，差异具有统计学意义，而Vector+Metformin组细胞中p-AKT/AKT、MMP2 和 MMP9 的表达水平显著下降， P＜0.05 ，差异具有统计学意义，oe_Girdin+Metformin组细胞中P-AKT/AKT的表达水平变化不大，P＞0.05，差异无统计学意义，MMP9的表达水平明显降低，P＜0.05，差异具有统计学意义，而 MMP2的表达水平变化不大，P＞0.05，差异无统计学意义；（3）稳定转染 Girdin 基因过表达慢病毒的 OVCAR3 细胞株经尾静脉注射细胞构建裸鼠肺转移瘤模型，空载和过表达组分别使用 200mg/Kg/d 的二甲双胍灌胃干预，对照组予生理盐水干预，5周后取肺组织HE染色，镜下观察转移结节数量。结果发现二甲双胍干预后与对照相比，肿瘤转移结节数目显著减少。
结论：1、Girdin 在上皮性卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中高表达，并与卵巢癌患者的病理分化程度、临床分期及远处转移具有显著相关性。2、AKT/Girdin 信号通路参与调控卵巢癌细胞株的增殖、侵袭及转移各个进程。3、二甲双胍可以通过调控Girdin的表达及磷酸化抑制卵巢癌细胞的侵袭及转移。