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实验目的:绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Thunb Makino)为葫芦科、绞股蓝属草质攀援植物,为东亚各国珍贵药食两用品种,在亚太地区广泛种植,对人体无毒副作用。绞股蓝能抗高血压、高血脂、高血糖,脂肪肝等症,还能调节机体免疫功能,具有极高的药用和保健开发价值。本课题组前期实验表明绞股蓝皂苷活性单体绞股蓝皂苷L(Gyp-L)有良好的抗肝癌和食管癌活性,可通过促进肿瘤细胞自噬和空泡化非凋亡性杀死细胞,但是其中还有部分机制不太明确,绞股蓝皂苷的单体通过诱导细胞衰老抑制肿瘤增殖进而抗肿瘤的活性和机制进行进一步的研究。方法:1.Gyp-L抗肿瘤活性研究:本实验进行过程中主要采用了肝癌和食管癌两个细胞株。使用CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测单体化合物在与抑制剂联用前后对肿瘤细胞生长与增殖的作用。并在加药前后比对细胞形态和数目的变化;2.Gyp-L抗肿瘤机制研究:(1)利用EdU(5-ethyny-2-deoxyurudine)染色检验加药前后细胞增殖能力的改变,β-半乳糖苷酶染色监测Gyp-L对肿瘤细胞老化的影响,使用qPCR检测细胞衰老相关外泌因子,如IL6、IL-1a、TIMP1、CYCL1、CYCL2在mRNA水平表达的变化;(2)流式细胞仪利用碘化丙啶法检测基因组DNA的荧光强度,以确定Gyp-L对细胞周期的影响并研究细胞周期阻滞发生的阶段;(3)利用Western Blot检测Gyp-L对细胞周期及衰老相关蛋白p18、p21和p27、p38、AKT、ERK、CDK2、CDK4、CDK6、CYCLIND1等的影响;(4)利用Western Blot检测Gyp-L对肿瘤细胞NFκB通路相关蛋白的影响;(5)GypL与p38蛋白抑制剂或IKBα蛋白抑制剂联合使用,进而检测肿瘤细胞衰老与增殖情况及周期和衰老有关蛋白合成量是否发生变化,确认Gyp-L如何发挥作用及其作用机理;(6)利用CCK8检测Gyp-L与顺铂或五氟尿嘧啶(5-FU)联合用药结果,研究Gyp-L是否能协同临床一线用药抑制肿瘤细胞。结果与讨论:1.Gyp-L对肝癌和食管癌具有良好的体外抗肿瘤活性;2.Gyp-L经由诱导细胞衰老压抑肿瘤细胞增殖;3.Gyp-L诱导细胞周期阻滞,使其不能进入G2期;4.Gyp-L可能通过激活ROS(reactive oxygen species)进而影响p38、ERK和NF-κB通路,激活细胞内衰老与周期阻滞关联蛋白表达,进而促进与衰老关联的炎症因子的排出,导致肿瘤细胞周期阻滞,细胞停止分化,最终抑制了肿瘤细胞的活性及增殖;5.Gyp-L促进顺铂和5-FU对肿瘤细胞的杀伤作用,增强临床一线用药的肿瘤杀伤能力。