论文部分内容阅读
背景:化疗性恶心呕吐（chemotherapy-induced nausea and vomiting,CINV）是肿瘤化疗过程中最常见的胃肠道不良反应,不但严重降低了肿瘤患者的生活质量,并且会导致肿瘤患者对化疗的依从性下降。目前临床上广泛使用的防治恶心呕吐的药物大多靶点单一并多需联合用药,不仅增加了副反应,且极大地增加了患者的经济负担。研究发现,5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）及5-HT3受体（5-HT3 receptor,5-HT3R）在CINV的发生机制中具有关键作用。顺铂等细胞毒化疗药物刺激肠嗜铬细胞（EC）释放5-HT,5-HT激动中枢和外周的5-HT3R导致呕吐的发生。小半夏汤是传统的止吐方剂,对多种原因导致的恶心呕吐都有较好疗效。我们前期的实验研究及文献报道均证实小半夏汤对CINV具有显著防治作用,其作用机制与降低5-HT水平、下调5-HT3R有关。小半夏汤中成分生姜及其有效物质6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚等也能通过阻断5-HT3R发挥止呕作用。国外有人采用呕吐动物模型研究发现,以5-HT3R选择性激动剂2-甲基-5-羟色胺（2-Methyl-5-hydroxytryptamine,2-Me-5-HT）激动5-HT3R可引起细胞内Ca2+浓度增加,启动了钙调蛋白（Calmodulin,CaM）与5-HT3R的连接,并导致钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK1/2）信号通路的激活,最终导致呕吐的发生。鉴于小半夏汤的止吐作用是否与调节5-HT3R介导的CaM/CaMKⅡ/ERK1/2信号通路有关尚未见研究报道,本实验在前期工作基础上,以5-HT3R后第二信使为切入点,以临床常用的化疗药顺铂和5-HT3R选择性激动剂1-苯基双胍盐酸盐（1-Phenylbiguanide hydrochloride,1-PBG）分别建立了两种大鼠异食癖恶心呕吐模型,观察小半夏汤对5-HT3R介导的CaM/CaMKⅡ/ERK1/2信号通路的影响,以进一步探讨小半夏汤防治CINV的作用机制。目的:在观察小半夏汤对顺铂、1-PBG致大鼠异食癖防治作用的基础上,以5-HT3R后第二信使作为切入点,探讨小半夏汤防治CINV的作用机制。方法:1.制备小半夏汤冻干粉并用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography,HPLC）对小半夏汤冻干粉的有效成分进行质量控制研究。2.将Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、顺铂模型组、顺铂-昂丹司琼治疗组、顺铂-小半夏汤治疗组4组。腹腔注射6 mg/kg顺铂建立化疗性大鼠异食癖恶心呕吐模型,每24 h称量并记录各组大鼠摄食高岭土量、摄食饲料量和体质量。免疫荧光技术检测CaM和5-HT3R在小肠和脑的表达及共定位作用;Western Blot技术检测CaMKⅡ、pCaMKⅡ、ERK1/2、pERK1/2在小肠和脑的表达水平。3.将Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、1-PBG模型组、1-PBG-昂丹司琼治疗组、1-PBG-小半夏汤治疗组4组。腹腔注射25 mg/kg 1-PBG建立大鼠异食癖恶心呕吐模型,每24 h称量并记录各组大鼠摄食高岭土量、摄食饲料量和体质量。免疫荧光检测CaM和5-HT3R在小肠和脑的表达及共定位作用;Western Blot方法检测CaMKⅡ、p CaMKⅡ、ERK1/2、pERK1/2在小肠和脑的表达水平。结果:1.小半夏汤冻干粉样品中6-姜酚的相对保留时间和相对峰面积结果为（15.285,4.3475）;6-姜烯酚的相对保留时间和相对保留面积结果为（0.376,0.0984）;麻黄碱的相对保留时间和相对峰面积结果为（17.097,43.9961）;琥珀酸的相对保留时间和相对峰面积结果为（7.025,3.0048）。2.与正常对照组比较,顺铂模型组大鼠在造模后24 h和72 h摄食高岭土量均显著增加（P<0.05）,说明大鼠异食癖模型造模成功;顺铂模型组大鼠小肠和脑组织中5-HT3R和CaM蛋白表达明显升高,共定位作用增强;顺铂模型组小肠和脑组织中CaMKⅡ、pCaMKⅡ、ERK1/2和pERK1/2蛋白表达增加（P<0.05）。与顺铂模型组比较,昂丹司琼治疗组和小半夏汤治疗组大鼠在造模后24 h和72 h高岭土摄入量均不同程度降低（P<0.05）;昂丹司琼和小半夏汤可以下调大鼠小肠和脑组织中5-HT3R和CaM蛋白的表达并减弱两个蛋白的共定位作用;昂丹司琼治疗组和小半夏汤治疗组大鼠小肠和脑组织中CaMKⅡ、pCaMKⅡ、ERK1/2和pERK1/2蛋白表达均减少。3.与正常对照组比较,1-PBG模型组大鼠在造模后24 h和72 h摄食高岭土量均显著增加（P<0.05）,说明大鼠异食癖模型造模成功;1-PBG模型组大鼠小肠和脑组织中5-HT3R和CaM蛋白表达明显上升,共定位作用增强;1-PBG模型组小肠和脑组织中CaMKⅡ、pCaMKⅡ、ERK1/2和pERK1/2蛋白表达增加（P<0.05）。与1-PBG模型组比较,昂丹司琼治疗组和小半夏汤治疗组大鼠在造模后24 h和72 h高岭土摄入量均不同程度降低（P<0.05）;昂丹司琼和小半夏汤可以下调大鼠小肠和脑组织中5-HT3R和CaM蛋白的表达并减弱两个蛋白的共定位作用;昂丹司琼治疗组和小半夏汤治疗组大鼠小肠和脑组织中CaMKⅡ、pCaMKⅡ、ERK1/2和pERK1/2蛋白表达均减少。结论:1.小半夏汤能抑制顺铂和5-HT3R选择性激动剂1-PBG诱导的大鼠异食癖行为,再次证实对CINV具有显著防治作用,而且该作用与阻断5-HT3R有关。2.小半夏汤防治CINV的机制与调控5-HT3R后CaM/CaMKⅡ/ERK1/2信号通路有关。