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肝纤维化是肝脏对各种原因所致慢性损伤的修复反应,表现为以胶原蛋白为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝脏内过度增生和沉积,是所有慢性肝损伤向肝硬化发展的必经阶段。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSCs)是肝纤维化中ECM的主要来源。活化的HSCs发生表型转变,获得肌成纤维细胞样特征,向肝损伤部位移行,增殖,合成分泌大量ECM,导致肝纤维化发生发展。HSCs是各种致纤维化因素的最终靶细胞,研究HSCs的生物学功能及其调控机制对于预防控制肝纤维化至关重要。由趋化因子CXCL12及其受体CXCR4组成的生物轴参与机体的炎症、免疫、损伤修复等多种病理生理过程。研究表明,CXCL12/CXCR4生物轴与多种组织器官纤维化密切相关,如肾,肺,前列腺等;然而,该生物轴在肝纤维化发病机制中的作用仍未阐明。RhoA,是ras同源基因家族的成员A,主要参与RhoA/ROCK通路,是近年来研究的明星分子,其与HSCs的活化、收缩、迁移和粘附密切相关;但是,RhoA在肝纤维化中的调节网络尚未明确。因此,为了探索CXCL12/CXCR4生物轴在肝纤维化发病机制中的作用以及与RhoA的调控关系,我们以大鼠肝纤维化模型和HSC-T6细胞株为研究对象,给予CXCR4抑制剂、RhoA抑制剂干预,并构建CXCR4过表达稳转细胞株,观察肝组织和细胞中相关分子的表达改变以及细胞的功能学变化。本研究工作从以下三个方面进行:第一部分 CXCL12/CXCR4轴和RhoA诱导肝星状细胞活化促进大鼠肝纤维化目的:观察CXCR4抑制剂和RhoA抑制剂干预肝纤维化大鼠模型后,各组大鼠肝纤维化程度、肝组织中CXCR4、α-SMA、COL1的表达情况以及RhoA活性变化。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为4组:正常组,模型组,CXCR4抑制剂组,RhoA抑制剂组(每组10只)。除正常组外,所有其他大鼠均采用皮下注射四氯化碳构建肝纤维化模型,每3天1次,持续8周。建模的同时,实施干预。CXCR4抑制剂组和RhoA抑制剂组分别给予CXCR4抑制剂(AMD3100)和RhoA抑制剂(Rhosin)每天腹腔注射。干预措施持续8周以后,处死所有大鼠,收集肝组织。使用HE和Masson染色评价各组肝脏的病理组织学变化;RT-qPCR和Western blot检测各组肝组织中CXCR4和α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;免疫组化检测各组肝组织中COL1和α-SMA的蛋白表达水平;Western blot检测各组肝组织中RhoA的相对活性。结果:正常组肝脏病理组织学结构正常,而模型组显示广泛的肝桥接纤维化和大量胶原沉积;但与模型组相比,CXCR4抑制剂组和RhoA抑制剂组的桥接纤维化和胶原沉积显著减少(P<0.01)。与正常组比较,模型组中CXCR4的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,CXCR4抑制剂组中CXCR4的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),但RhoA抑制剂组中的CXCR4表达水平没有明显变化(P>0.05)。与正常组比较,模型组中α-SMA和COL1的表达水平、RhoA的相对活性均显著升高(P<0.05);然而,与模型组相比,CXCR4抑制剂和RhoA抑制剂组中α-SMA和COL1的表达水平、RhoA的相对活性均显著降低(P<0.05)。结论:CXCL12/CXCR4轴和RhoA参与了肝纤维化的发病机制,抑制CXCR4的表达和RhoA活性可减轻肝纤维化;CXCL12/CXCR4轴和RhoA可影响HSCs的活化,抑制CXCR4的表达和RhoA活性可降低HSCs的活化;CXCL12/CXCR4 轴可能影响 RhoA 的活性,但 RhoA 对 CXCL12/CXCR4轴没有明显影响。第二部分 CXCL12/CXCR4轴和RhoA促进肝星状细胞活化、增殖和迁移目的:观察CXCR4抑制剂和RhoA抑制剂干预HSC-T6细胞以及转染CXCR4过表达慢病毒以后,各组细胞中CXCR4、α-SMA、COL1的表达情况、RhoA活性变化以及各组细胞的功能学变化。方法:将HSC-T6细胞用PDGF-BB激活,并随机分为6组:空白组(Blank),溶剂对照组(PBS),CXCR4 抑制剂组(CXCR4 inhibitor),空载体组(Empty vector),CXCR4 过表达组(CXCR4 overexpression,CXCR4-OE)和 RhoA 抑制剂组(RhoA inhibitor)。CXCR4 抑制剂组和 RhoA抑制剂组分别给予AMD3100和Rhosin处理细胞;溶剂对照组给予等体积的PBS溶液处理细胞;空白组不给予任何处理。空载体组和CXCR4过表达组分别转染空载体和CXCR4过表达慢病毒。通过RT-qPCR和Western blot检测各组细胞中CXCR4和α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;G-LISA Activation Assay检测各组细胞的RhoA活性;ELISA检测各组细胞中COL1的表达;CCK-8法检测各组细胞的增殖率;Transwell实验检测各组细胞的迁移能力;流式细胞术测定各组细胞的凋亡率和细胞周期分布。结果:与空白组相比,空载体组和溶剂对照组中CXCR4和α-SMA表达量无明显变化(P>0.05);与溶剂对照组相比,CXCR4抑制剂组中CXCR4和α-SMA的mRNA和蛋白表达量均显著下降(P<0.05);RhoA抑制剂组中α-SMA的mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05);与空载体组相比,CXCR4过表达组中CXCR4和α-SMA的mRNA和蛋白表达量均显著增加(P<0.01)。与空白组比较,溶剂对照组和空载体组中RhoA活性和COL1表达量没有明显变化(P>0.05);与溶剂对照组相比,CXCR4抑制剂组和RhoA抑制剂组中RhoA活性和COL1表达量显著降低(P<0.05);与空载体组相比,CXCR4过表达组中RhoA活性和COL1表达量显著增加(P<0.01)。与空白组相比,空载体组和空载体组中细胞增殖率和迁移能力无明显变化(P>0.05);与溶剂对照组相比,CXCR4抑制剂组和RhoA抑制剂组中细胞增殖率和迁移能力明显降低(P<0.05);与空载体组相比,CXCR4过表达组的细胞增殖率和迁移能力显著增加(P<0.05)。与空白组相比,空载体组和溶剂对照组中细胞的凋亡率和各周期(G1、S和G2/M)的细胞比例无明显变化(P>0.05);与溶剂对照组相比,CXCR4抑制剂组和RhoA抑制剂组中细胞凋亡率和处于各周期的细胞比例无明显变化(P>0.05);与空载体组相比,CXCR4过表达组中细胞凋亡率和处于各周期的细胞比例也无明显变化(P>0.05)。结论:CXCL12/CXCR4轴和RhoA可促进HSCs的活化、增殖和迁移,从而发挥促纤维化作用;CXCL12/CXCR4轴可能通过调控RhoA活性,从而影响HSCs的功能;在肝纤维化中,CXCL12/CXCR4轴和RhoA可能对HSCs的凋亡和细胞周期没有影响。第三部分 CXCL12/CXCR4轴通过上调RhoA活性促进肝星状细胞活化、增殖和迁移目的:为了明确CXCL12/CXCR4轴与RhoA的调控关系,使用RhoA抑制剂干预CXCR4过表达的HSC-T6细胞以后,观察各组细胞中CXCR4、α-SMA、COL1的表达情况、RhoA活性变化以及各组细胞的功能学变化。方法:设计Rescue实验,将CXCR4过表达细胞随机分为3组:CXCR4-OE 组(CXCR4 过表达组)、CXCR4-OE+PBS 组、CXCR4-OE+RhoA抑制剂组。CXCR4-OE+RhoA抑制剂组和CXCR4-OE+PBS组分别给予RhoA抑制剂(Rhosin)和PBS溶液处理细胞;CXCR4-OE组不给予任何处理。通过RT-qPCR和Western blot检测各组细胞中CXCR4和α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;G-LISA Activation Assay检测各组细胞的RhoA活性;ELISA检测各组细胞中COL1的表达;CCK-8法检测各组细胞的增殖率;Transwell实验检测各组细胞的迁移能力。结果:与 CXCR4-OE 组相比,CXCR4-OE+PBS 组中 RhoA活性、α-SMA的mRNA及蛋白表达量、COL1的蛋白表达量没有明显变化(P>0.05);然而,与CXCR4-OE+PBS组相比,CXCR4-OE+RhoA抑制剂组中RhoA活性、α-SMA的mRNA及蛋白表达量、COL1的蛋白表达量均明显降低(P<0.05)。与CXCR4-OE组相比,CXCR4-OE+PBS组中细胞增殖率和迁移能力没有明显变化(P>0.05)。然而,与CXCR4-OE+PBS组相比,CXCR4-OE+RhoA抑制剂组中细胞的增殖率和迁移能力均明显下降(P<0.05)。结论:在肝纤维化中,RhoA是CXCL12/CXCR4轴的下游分子;CXCL12/CXCR4轴可通过上调RhoA活性来促进HSCs的活化、增殖和迁移,导致肝纤维化发生发展。